Characterisation of protein-protein interactions of membrane proteins from Hordeum vulgare and Arabidopsis thaliana involved in plant immunity

• Charakterisierung von Protein-Protein-Interaktionen von Membranproteinen aus Hordeum vulgare und Arabidopsis thaliana beteiligt an der Pflanzenabwehr

Sabelleck, Björn; Panstruga, Ralph (Thesis advisor); Schaffrath, Ulrich (Thesis advisor)

Aachen (2019, 2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Pflanzen besitzen ein komplexes Immunsystem, welches fähig ist eine Pflanze gegen eine Vielzahl von Mikroben zu verteidigen. Um verschiede Mikroben wahrzunehmen, haben Pflanzen Rezeptor-ähnliche Kinasen und Rezeptor-ähnliche Proteine entwickelt, welche in der Plasmamembran lokalisiert sind. Diese Rezeptoren binden mikrobenspezifische Moleküle an der extrazellulären Seite und können ein Signal durch Phosphorylierungsreaktionen in ein zelluläres Signal umwandeln. Eine Abwehrsignalkaskade wird gestartet, um das Wachstum der Mikrobe zu verhindern. Neben Rezeptor-ähnliche Kinasen befinden sich in der Plasmamembran auch andere Proteine, die in der Pflanzenabwehr eine wichtige Rolle spielen. Wie diese Proteine mit anderen Proteinen interagieren und welche Bedeutung die Interaktion spielt, ist nur teilweise geklärt. Das übergreifende Ziel dieser Arbeit ist die Identifizierung von neuen physikalischen Interaktionspartnern von plasmamembran-lokalisierten Proteinen, denen eine Aufgabe bei der Pflanzenabwehr zukommt. Als Hauptmethode wurde das Split-Ubiquitin Hefe-Zwei-Hybrid-System genutzt. Dieses hefebasierte System wurde designt, um Protein-Protein-Interaktionen an der Plasmamembran zu identifizieren, wozu das klassische Hefe-Zwei-Hybrid-System nicht in der Lage ist. Zwei verschiedene Split-Ubiquitin Hefe-Zwei-Hybrid-Systeme wurden getestet und verschiedene cDNA-Bibliothek-Screens wurden durchgeführt. Es wurde eine Bibliothek verwendet, die aus Effektorproteinen des Mehltaupilzes Blumeria graminis f. sp hordei besteht. Diese Bibliothek wurde gegen Rezeptor-ähnliche Kinasen von Gerste und Weizen getestet, für welche eine Rolle in der Nicht-Wirts-Resistenz angenommen wird. Dabei konnten potenzielle Effektorproteine identifizieren werden, die mit zwei dieser Rezeptor-ähnlichen Kinasen interagieren, was im Hefesystem bestätigen werden konnte. Zusätzlich wurde das Split-Ubiquitin Hefe-Zwei-Hybrid-System für die Identifizierung von neuen Interaktionspartnern vom Gersten Mlo-Protein verwendet. Die biochemische Funktion dieses Proteins mit sieben Transmembrandomänen ist bis heute unklar, aber ein Ausschalten von bestimmten Genen dieser Familie führt zur kompletten Mehltauresistenz. Ein Interaktionsscreen wurde herangezogen, um neue Anhaltspunkte auf die biochemische Funktion zu bekommen. Hierbei konnten zwei potenzielle Interaktionspartner aus Gerste identifiziert werden, welche in der Zukunft noch weiter bestätigt werden müssen. Die Überexpremierung von einem Kandidaten - einer O-Methyltransferase - führt zur erhöhten Resistenz gegen Gerstenmehltau. Außerdem konnten zwei potenziell interagierende Effektorproteine bestimmt werden, wobei ein Kandidat (CSEP0515) nicht in BiFC Experimenten bestätigen konnte. Der zweite Effektor muss noch getestet werden. Zuletzt wurde das Hefesystem verwendete, um neue Interaktionspartner des Arabidopsis thaliana Chitin Rezeptors CERK1 zu identifizieren. In Hefe und in planta Split-Luziferase Experimenten konnte gezeigt werden, dass CERK1 mit Calmodulin, einer Plasmamembran H+ ATPase (AHA2) und dem Protein PCC1 interagiert. Die Funktion der Interaktion mit Calmodulin und AHA2 muss noch weiter untersucht werden. PCC1 gehört zu einer Proteinfamilie in Eukaryoten, die auf biotischen und abiotischen Stress reagiert. Es besitzt einen speziellen Bereich, welcher cystein-reicher-transmembran Bereich genannt wird. In silico Analysen und Interaktionsdaten weisen darauf hin, dass diese Familie Homo- und Heterodimere bildet und dass bestimmte Mitglieder ähnliche Expressionsmuster haben. Für die Interaktion mit PCC1 konnte folgendes gezeigt werden: 1. Die Interaktionsstelle in PCC1 konnte eingrenzt werden; 2. Es konnte gezeigt werden, dass auch andere Familienmitglieder mit CERK1 interagieren können; 3. Indizien für die Phosphorylierung des N-terminus von PCC1 konnten geliefert werden und 4. Es konnte gezeigt werden, dass auch andere Rezeptor-ähnliche Kinasen der Pflanzenabwehr, wie LYK4, LYK5, BAK1, EFR und FLS2 mit PCC1 interagieren können. Zwei Arabidopsis thaliana Mutantenlinien von PCC1 zeigten nicht aussagekräftigte ROS Burst Phänotypen. Eine knock-down Mutante zeigte eine reduzierte ROS Antwort, wenn Chitin oder elf18 verwendet wurde, wobei die knock-out Mutante wildtyp-ähnliche Antwort zeigte.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Molekulare Zellbiologie der Pflanzen [161920]