Development of engineered lipases for enhanced surface binding and polymerization applications by directed evolution

Höck, Heidi; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Möller, Martin (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Die enzymatische Katalyse gewinnt für die Entwicklung nachhaltiger und umweltfreundlicher Verfahren in der chemischen Industrie, der pharmazeutischen Industrie und der Lebensmittelindustrie zunehmend an Bedeutung. Eine zentrale Frage in unserer modernen Gesellschaft ist die Rezyklierbarkeit und zirkuläre Ökonomie von Kunststoffen. Lipasen haben ein großes Potenzial für die Polymerisation von biologisch abbaubaren Polyestern. Da die Hydrolyse von Estern die natürliche Reaktion von Lipasen ist, wurde Enzym-Engineering, gerichtete Evolution und rationales Design, angewandt, um Candida antarctica Lipase B (CaLB) zu optimieren und ihre katalytische Aktivität für die Polymerisation von ε-Caprolacton in "grünen" Lösungsmitteln zu verbessern. Gelenkte Evolution und rationales Design wurden zur Erzeugung optimierter Enzym-Katalysatoren verwendet. Diese Arbeit fokussiert sich nicht nur auf den Katalysator selbst, sondern auch auf die Verbesserung der Expression von CaLB, die Entwicklung geeigneter Screening Methoden in Hefe, sowie der Entwicklung neuer Immobilisierungsstrategien des Enzyms. Eine erfolgreiche Strategie zum Enzym-Engineering beruht auf einem stabilen Expressionssystem und einem verlässlichen Screening-System. In Kapitel 2 wurde der MFα-Sekretionsfaktor mit Hilfe der gelenkten Evolution mutiert, um die Sekretion von CaLB in Saccharomyces cerevisiae zu verbessern können. Die gelenkte Evolutionskampagne des MFα-Sekretionsfaktors ergab eine 2,4-fach höhere Produktion der Lipase im Vergleich zum nativen Sekretionsfaktor. Das entwickelte Protokoll ermöglichte sehr hohe Mutationsfrequenz aufgrund hoher Mangan Konzentrationen in der "error prone" PCR. Ein Nadelöhr in der Enzymtechnik ist die Notwendigkeit eines messbaren Substrats, das mit dem Zielsubstrat vergleichbar ist. In Kapitel 3 wurde das Modellenzym CaLB auf einem Goldchip immobilisiert. Ziel dieser Immobilisierung ist es, während der katalytischen Reaktion eine elektrische Impedanz Spektroskopie durchzuführen, um Änderungen im Spektrum der Substratlösung zu beobachten. Drei verschiedene Ansätze zur Immobilisierung von CaLB wurden analysiert und verglichen: (i) Adsorption; (ii) kovalente Bindung; (iii) Ankerpeptide. Es wurde gezeigt, dass durch gerichtete Immobilisierung die Aktivität des Enzyms der Goldoberfläche gemessen werden kann. Ankerpeptide, wie z.B. das LCI, zeigten im Vergleich zu den beiden weiteren getesteten Methoden das größte Potenzial zur funktionalen Immobilisierung von CaLB auf Goldchips. In Kapitel 4 wurde die Enzymtechnik eingesetzt, um entgegen der natürlichen Reaktion von Lipasen, die Hydrolyse von Estern, zu unterdrücken und einen Katalysator zu entwickeln, der in wässriger Umgebung eine Polymerisation von ε Caprolacton zu Polycaprolacton durchführen kann. Zwei verschiedene Strategien wurden in Kombination mit einer Immobilisierung des Enzyms in einem Mikrogel verfolgt. Es wurde gezeigt, dass die Erhöhung der Hydrophobizität der Lipaseoberfläche durch rationales Enzym-Engineering die Polymerisationsfähigkeit positiv beeinflusst. Das Erhöhen der hydrophoben Deckelstruktur führte zu einer 1,2 fach und die Deglycosylierung der Lipase zu einer 1,7 fach besseren Polymerisation von ε Caprolacton durch die Lipase CaLB. Die Immobilisierung in einem hydrophoben Mikrogel verstärkte diesen Effekt, so dass eine höhere Polymerisationsaktivität erhalten wurde.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]