Investigations on transglycosylation reactions of glycosidases and glycosynthases for the syntheses of (poly-)N-acetyllactosamine glycans

• Untersuchungen zu Transglykosylierungsreaktionen von Glykosidasen und Glykosynthasen für die Synthesen von (poly-)N-Acetyllaktosamin Glykanen

Henze, Manja; Elling, Lothar (Thesis advisor); Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Zunehmende ökologische Bedenken treibt das Forschungsinteresse an, "synthetische Spielwiesen" in biogetriebener Katalyse von Kohlenhydraten zu erweitern. Die Herausforderung liegt darin, die Lücken zwischen natürlich vorkommenden Eigenschaften eines Biokatalysators und den Anforderungen eines Industrieprozesses, zu schließen. Im Sinne dieser Nachfrage wird eine nächste Generation von robusten Biokatalysatoren, gekennzeichnet durch verringerte Produkthydrolyse, ungewöhnliche Reaktionstemperatur oder Medienzusammensetzung, angestrebt, mit dem allgemeinen Ziel hohe Produktausbeuten zu erreichen. Demzufolge sind Glykosid-Hydrolasen, aufgrund ihrer Verwendbarkeit in der Großproduktion und der kostengünstig erwerblichen Rohstoffe, hervorragende Katalysatoren um eine grüne Synthese von hochwertigen Zuckerstrukturen zu ermöglichen. Diese Dissertation zeigt die Nutzung der Glykosid-Hydrolasen von Bacillus circulans und Pyrococcus woesei für die Synthesen von (poly-)N-Acetyllaktosamin (LacNAc)-Derivaten auf. LacNAc ist ein grundlegendes Motiv in Säugetierglykoproteinen mit großem Potential für pharmazeutische Anwendungen. Die Synthese von LacNAc-Strukturen in Tansgalaktosylierungen mit β-Galaktosidasen wird allerdings oft von der Hydrolyse des Donorsubstrates und des Produkts begleitet. Um diese Nachteile zu überwinden liegen zwei grundsätzliche strategische Richtungen, Protein- und Reaktionsengineering, vor. Wird der Proteinengineering-Route gefolgt, hat vor allem die Entwicklung von nukleophilen Mutanten von Glykosidasen (Glykosynthasen) Aufmerksamkeit erlangt. Zur Erzeugung einer Glykosynthase wurde, basierend auf der Proteinstruktur der mesophilen Bacillus circulans β-Galaktosidase (BgaC) aus der Glykosid-Hydrolase Familie 35, die katalytische Glutaminsäure an Position 233 durch nicht-nukleophile Aminosäuren ausgetauscht. Dadurch wurde eine eliminierte hydrolytische Aktivität mit aufrechterhaltender Transglykosylierungsleistung für His6BgaC/Glu233Gly erreicht. Eine systematische Synthese der LacNAc Typ 1 (3Galβ1-3GlcNAcβ1-, Lacto-N-biose) Struktur wurde durch die Optimierierung von Schlüsselparametern wie Enzymkonzentration, Donor/Akzeptor-Verhältnis und Akzeptorkonzentration, realisiert. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass die resultierende aktive Glykosynthase His6BgaC/Glu233Gly für die stereo- und regioselektive Synthese von β1-3-verknüpften Galaktosiden mit verschiedenen N-Acetylglukosamin-Akzeptorsubstraten mit mäßigen bis hohen Ausbeuten geeignet ist. Darüber hinaus stellen die funktionalisierten Lacto-N-biose-Verbindungen einen Ausgangspunkt für Kopplungs-Reaktionen an Biomaterialoberflächen dar. Die Glykosynthase His6BgaC/Glu233Gly ermöglichte, in Kombination mit zwei rekombinanten Glykosyltransferasen, β1,3-N-Acetylglukosaminyltransferase von Helicobacter pylori (β3GlcNAcT) und humane β1,4-Galaktosyltransferase-1 (β4GalT-1), den individuellen modularen Aufbau von Typ 1 (3Galβ1-3GlcNAcβ1-) und Typ 2 (3Galβ1-4GlcNAcβ1-) LacNAc-Oligomeren, durch sequentielle - oder Eintopf-Reaktionsprozesse. Zum ersten Mal wurden poly-LacNAc Typ 1 Oligomer und gemischte Typ 2/Typ 1 poly-LacNAc Oligomere hergestellt. Der zweite Teil dieser Dissertation befasst sich mit der hyperthermophilen β-Glykosidase aus Pyrococcus woesei. Zunächst wurde Mikrowellen-unterstützte Synthese - eine Haupttechnologie in der grünen Chemie - erfolgreich in Transglykosylierungsreaktionen mit Laktose als Donorsubstrat angewandt. Reaktionen unter Mikrowelleneinstrahlungen, die bei einer Temperatur weit unter der optimalen Temperatur dieses Thermozyms durchgeführt wurden, resultierten in höheren Produktausbeuten bei gleichzeitiger Reduzierung der Nebenprodukte. Dieser anspruchsvolle Versuchsaufbau veranschaulicht eine generelle Synthesestrategie für einen hyperthermophilen Biokatalysator unter Verwendung von hitzesensitiven Substraten. Schließlich war die Kombination der Mikrowellen-Heiztechnologie und der Molekulartechnik dieser thermophilen Glykosidase eine logische Konsequenz, um die Untersuchungen zu verschiedenen enzymatischen Strategien mit Glykosidasen zu vervollständigen. Aus diesem Grund wurden drei aktive Glykosynthasen (Glu414Gly, Glu414Ser, Glu414Ala) von der hyperthermophilen Glykosidase erzeugt. Bemerkenswerterweise zeigten alle Varianten die Fähigkeit zur Transglykosylierung mit drei verschiedenen α-Glykosylfluoriden (αGalF, αGlcF, αManF). Im Anschluss daran wurde zur Steigerung der Produktausbeute von LacNAc Typ 2 eine detaillierte Untersuchung der optimalen Reaktionsbedingungen mit αGalF durchgeführt. Darüber hinaus führten Transgalaktosylierungsreaktionen mit der hyperthermophilen Glykosynthase Glu414Ala und dem hitzelabilen Glykosylfluorid unter Mikrowelleneinstrahlung, verglichen mit Reaktionen unter thermischer Erwärmung bei vergleichbaren Temperaturen, zu erhöhten Produktausbeuten. Zusammenfassend zeigen die vorgestellten Ergebnisse die Leistungsfähigkeit des rationalen Proteindesigns und des Reaktionsengineerings für die Herstellung von maßgeschneiderten N-Acetyllaktosamin-Glykanstrukturen unter Verwendung von Glykosidasen und Glykosynthasen.

Einrichtungen

• Lehr- und Forschungsgebiet Biomaterialien [162820]
• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]