Erythropoietin dependent regulation of the anti-apoptotic TMBIM family members FAIM2 and GRINA after murine cerebral ischemia

• Erythropoietin abhängige Regulation der anti-apoptotischen TMBIM-Familienmitglieder FAIM2 and GRINA nach zerebraler Ischämie in der Maus

Habib, Pardes; Marquardt, Till (Thesis advisor); Spehr, Marc (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Die zerebrale Ischämie ist die häufigste Form des Schlaganfalls und gehört zu den führenden Invaliditäts- und Todesursachen weltweit. Beim ischämischen Schlaganfall führt eine arterielle Okklusion zu einem lokal reduzierten Blutfluss des betroffenen Gehirnareals mit konsekutiv vitaler Bedrohung. Im Vergleich zu den aktuellen Fortschritten der akuten endovaskulären Reperfusionsmaßnahmen (u.a. mechanische Thrombektomie) steht ein Durchbruch für primär neuroprotektive und -regenerative Ansätze noch aus. Die Modulation der Apoptosewege und der endogenen Neuroprotektion im Bereich der unmittelbar an den Schlaganfallkern angrenzenden Penumbra stellen wesentliche Ansätze neuer experimenteller Strategien dar, um die neuronalen Schäden zu begrenzen. Der evolutionär hochkonservierten und ubiquitär exprimierten Transmembrane BAX Inhibitor-1 Motifcontaining (TMBIM) Proteinfamilie wird eine maßgebliche Rolle bei der Erhaltung der intrazellulären Calcium-Homöostase und der Inhibition von Apoptose zugesprochen. TMBIM2/FAIM2 und TMBIM3/GRINA zeigen eine ähnliche Sekundärstruktur und sind in den Membranen vom Endoplasmatischem Retikulum (ER) und/oder in den Plasmamembranen des zentralen Nervensystems (ZNS) zu finden. FAIM2 zeigte neuroprotektive und -regenerative Effekte im murinen Fadenokklusionsmodell (transient middle cerebral artery occlusion, tMCAo) und wird durch Erythropoietin (EPO) reguliert. Die Fragen, ob auch GRINA unter ischämisch/hypoxischen Bedingungen eine ähnliche protektive Funktion besitzt, und ob FAIM2 und GRINA kompensatorisch/synergistisch agieren könnten, waren unbeantwortet. Des Weiteren war nicht bekannt, ob EPO neben der Expression von Faim2 auch die von Grina reguliert. Um diese Fragen zu adressieren, wurden FAIM2-defiziente (Faim2-/-), GRINA-defiziente (Grina-/-) und doppel-defiziente (Faim2-/-Grina-/-) Mäuse einer 30-minütigen tMCAo- oder einer Sham-Operation mit einer anschließenden Reperfusionszeit von 6 h und/oder 72 h unterzogen. EPO wurde direkt nach der tMCAo sowie nach 24 h und 48 h injiziert. Für zell- spezifische Interaktionen wurden primäre neuro-/gliale Zellkulturen der oben genannten Mausmutanten mittels eines in vitro Ischämie-Modells (oxygen-glucose-deprivation, OGD) stimuliert. Des Weiteren wurde in primären kortikalen Neuronen der Effekt der Überexpression bzw. Wiedereinführung beider TMBIM-Gene in o.g. Modell untersucht. Es konnten eine hohe Expression beider TMBIM-Familienmitglieder im murinen Gehirn nachgewiesen werden. Sowohl Faim2-/- - als auch Grina-/- Mäuse zeigten gleichermaßen signifikant größere Infarktvolumina und damit einhergehende schwerwiegendere neurologische Defizite als die korrespondierenden Wildtypkontrollen (WT). Das Fehlen beider TMBIM-Familienmitglieder potenzierte die Läsionslast weiter. Nach EPO-Gabe zeigten ausschließlich die WT-Mäuse reduzierte Infarktgrößen und eine verbesserte Klinik. Während das Fehlen von FAIM2 die Aktivierung von Caspase 8 potenzierte, konnte in Grina-/- Mäusen eine starke Aktivierung von Caspase 9 beobachtet werden. Auch die primären kortikalen Neurone der FAIM2 und/oder GRINA-defizienten Mäuse zeigten nach OGD eine deutlich beeinträchtigte Ischämie-Toleranz im Vergleich zu den Wildtypen. Die Überexpression von Grina und Faim2 in Wildtypneuronen und die Wiedereinführung beider TMBIM- Gene, allein oder in Kombination, verhinderten signifikant den OGD-induzierten Zelltod in doppel-defizienten Neuronen. Eine zerebrale Ischämie kann zu Proteinfehlfaltung und zum ER-Stress führen, wodurch eine komplexe Antwort zur Wiederherstellung der physiologischen Zellfunktion, die sogenannte "Unfolded Protein Response (UPR)" aktiviert wird. Da GRINA hauptsächlich an der ER-Membran lokalisiert ist und die Ca2+-Freisetzung durch Interaktion mit dem Inositol- 1,4,5-Trisphosphat-Rezeptor inhibiert, wurde vermutet, dass GRINA eine entscheidende Rolle in der UPR spielen könnte. Daher wurde in einer zweiten Studie der Einfluss von GRINA und EPO auf die post-ischämische UPR in Grina-/- - und WT-Mäusen untersucht. Zur Untersuchung der UPR-Signalkaskaden wurden primäre kortikale Mischzellkulturen mittels OGD oder pharmakologisch mit Tunicamycin und Thapsigargin stimuliert. Die Behandlung mit dem PERK-Inhibitor GSK-2606414, dem IRE1α-RNase-Inhibitor STF-083010 und EPO erfolgte 1 h vor oder 1 h, 2 h oder 3 h nach OGD. Diese Studie lieferte Hinweise, dass sowohl der IREa als auch der PERK-Arm des UPR in der frühen Reperfusionsphase (6 h) nach einer zerebralen Ischämie aktiviert werden. In Grina-/- Mäusen wurde neben einer erhöhten Apoptose auch eine signifikant höhere Aktivierung des PERK-Armes der UPR verglichen mit WT beobachtet. EPO verstärkte die post- ischämische Aktivierung des protektiven IREa-Weges und dämpfte die pro-apoptotische PERK-Kaskade. Neben EPO reduzierte auch der PERK-Inhibitor GSK-2606414 den post- ischämischen Zelltod und regulierte die Grina Transkription nach ODG. Zusammenfassend wurde gezeigt, dass beide TMBIM-Proteine eine relevante Rolle in der EPO-vermittelten Neuroprotektion nach zerebraler Ischämie spielen. FAIM2 scheint im extrinsischem Apoptoseweg (Caspase 8) und GRINA im intrinsischem (Caspase 9) involviert zu sein. Des Weiteren, scheint GRINA in der post-ischämischen Modulation der UPR, insbesondere im PERK-Arm, beteiligt zu sein. Neben den Erkenntnissen zum Wirkmechanismus von EPO nach zerebraler Ischämie, weisen unsere Studien auch auf eine potentielle therapeutische Relevanz von PERK-Inhibitoren nach Schlaganfall hin.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Neurobiologische Forschung [164310]