Identification, validation and characterization of novel DNA methylation biomarkers for liquid biopsy based early breast cancer detection and therapy monitoring in non-small cell lung cancer

• Identifizierung, Validierung und Charakterisierung neuartiger DNA-Methylierungs-Biomarker für die auf Flüssigbiopsie basierende Früherkennung von Brustkrebs und Therapieüberwachung in nicht-kleinzelligem Lungenkrebs

Mijnes, Jolein; Dahl, Edgar (Thesis advisor); Panstruga, Ralph (Thesis advisor); Pradel, Gabriele (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Hintergrund: Brustkrebs ist nach wie vor die am häufigsten diagnostizierte Krebsart und die häufigste Krebstodesursache bei Frauen. Die Mammographie wird derzeit für die Brustkrebs-Früherkennung eingesetzt, zeigt jedoch erhebliche Einschränkungen. Lungenkrebs ist die am häufigsten diagnostizierte Krebsart bei Männern und die dritthäufigste Krebsart bei Frauen. NSCLC tritt nach der Therapie häufig und schnell wieder auf und erfordert eine genaue Überwachung der Krankheit. Blutbasierte Ansätze bieten innovative, minimal-invasive Tools, die zur Charakterisierung epigenetischer Veränderungen von Tumorsuppressorgenen eingesetzt werden können. Daher könnte der Nachweis der Hypermethylierung zellfreier DNA (cfDNA) als Flüssigkeitsbiopsie als Ergänzung zur Mammographie und Überwachung von NSCLC-Patienten dienen. Methoden: Potenzielle Biomarker für die Brustkrebs-Früherkennung, SPAG6, PER1 und NKX2-6, wurden aus The Cancer Genome Atlas (TCGA) unter Verwendung von HumanMethylation450-BeadChip-Daten identifiziert. ITIH5 wurde auf Basis vorherige Ergebnisse aufgenommen. In der hier vorgestellten Studie wurde die Validierung dieser Marker sowohl im Serum (n = 467) als auch im Plasma (n = 50) verfolgt. SPAG6 wurde zuvor bei Brustkrebs nicht beschrieben. Es wurde Immunhistochemie an einer formalin fixierten, paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebekohorte (n = 92) und einem Tissue Microarray (TMA, n = 776) durchgeführt. SPAG6-GFP überexprimierende MDA-MB-231- und T-47D Brustkrebszelllinien wurden in In vitro Zellkultur assays verwendet, um die Auswirkungen auf Proliferation, Apoptose, Migration, Koloniebildung und Invasion zu testen. Darüber hinaus wurde eine Immunmarkierung auf fixierten Zellen durchgeführt. Zur Identifizierung von Hypermethylierungs-Biomarkern für die Überwachung von NSCLC-Patientinnen wurde als proof-of-principle die Reduced Representation Bisulfite Sequencing (RRBS) auf der Analyt cfDNA etabliert. Zu diesem Zweck wurden Blutproben von NSCLC-Patienten (n = 13) analysiert. COPD-Patienten wurden als Kontrollen verwendet. Ergebnisse: Auf Basis von SPAG6 und ITIH5 konnte in einer Serumtestkohorte (80% Spezifität) das duktale Karzinom in situ (DCIS) mit einer Sensitivität von 63% und in früh invasive Brustkrebs mit 51% Sensitivität nachgewiesen werden. Die Sensitivität für DCIS konnte durch Hinzufügen von PER1 und NKX2-6 zum Panel auf 70% erhöht werden. Die Brustkrebserkennung in einer Serumvalidierungskohorte erwies sich als schwierig, vor allem aufgrund der präanalytischen Bedingungen. Unter Berücksichtigung dieser präanalytischen Bedingungen konnte die Sensitivität für den Brustkrebsnachweis in einer Plasmakohorte unter Verwendung aller vier Gene auf 81% (83% Spezifität) erhöht werden. Nach erfolgreicher Etablierung eines RRBS-Protokolls für cfDNA war es möglich, unterschiedlich methylierte CpGs zwischen NSCLC- und COPD-Patientinnen zu identifizieren: Die Gene MYO1D und XRRA1 zeigten eine höhere Methylierungsfrequenz bei NSCLC, ebenso wie sechs RNAs (BC017002 (mRNA), BC070106 (mRNA), MG828791 (lncRNA), MG828792 (lncRNA), JB175072 (piRNA) und RNA5-8SP2 (rRNA). Die identifizierten Regionen wurden zuvor nicht in der Literatur beschrieben. Klinische Daten wiesen auf eine Assoziation von SPAG6 mit aggressiveren Tumoren hin. Der gleiche Trend wurde in Zellkulturexperimenten gefunden: Die Migration wurde durch eine Überexpression von SPAG6 verstärkt und EMT induziert. Darüber hinaus wurde die Apoptose durch SPAG6 beeinflusst. Die Immunmarkierung zeigte eine Überlappung zwischen SPAG6-GFP und Mikrotubuli. Schlussfolgerung: Trotz der mit Flüssigbiopsie-Anwendungen verbundenen Herausforderungen konnten SPAG6, PER1 und NKX2-6 als blutbasierte Marker für die Brustkrebs-Früherkennung identifiziert worden. Die Quantifizierung der Promotor-Methylierung in aus Plasma isolierter cfDNA könnte in Zukunft ein empfindliches und spezifisches Instrument zur Ergänzung der Brustkrebs-Früherkennungsstrategien sein. Auch wenn sie vielversprechend ist, sind weitere technische Entwicklung und klinische Validierung erforderlich. Die Implementierung des RRBS-Protokolls sowie die bioinformatische Analyse-Pipeline und die Auswertung der Daten wurden erfolgreich etabliert und abgeschlossen. Im Allgemeinen scheint SPAG6 mit fortgeschritteneren und aggressiveren Brusttumoren assoziiert zu sein, wo es eine anscheinend onkogene Rolle spielt da es die Migration stimuliert und EMT induziert. SPAG6 könnte in verschiedenen Stadien der Tumorentwicklung unterschiedliche Funktionen haben.

Einrichtungen

• [528001-2]
• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Molekulare Zellbiologie der Pflanzen [161920]