Proteomics as an alternative approach for hazard characterization and the identification of specific chemical targets : elucidation of potential biomarkers for differentiating endocrine disruption from hepatotoxicity

Ayobahan, Steve Uwa; Hollert, Henner (Thesis advisor); Schäfers, Christoph (Thesis advisor); Schäffer, Andreas (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Die ökotoxikologische Prüfung der chemischen Auswirkungen auf die reproduktive endokrine Funktion für regulatorische Zwecke konzentriert sich derzeit eher auf die Charakterisierung apikaler Endpunkte als auf die Identifizierung der molekularen Mechanismen, die für die beobachteten Nebenwirkungen verantwortlich sind. Insbesondere können Veränderungen der Endpunkte und Biomarker im Zusammenhang mit der Reproduktion, wie Vitellogeningehalt (VTG), Gonadenmorphologie und Fruchtbarkeit, auch durch Störungen beeinträchtigt werden, die nicht mit dem gestörten endokrinen System verbunden sind. Da die Leber der Ort der VTG-Produktion ist, können auch Hepatotoxika ähnliche Veränderungen an diesem Biomarker hervorrufen. Da die Regulierung von Chemikalien unterschiedlich ist, wenn sie als endokrine Disruptoren identifiziert werden, besteht ein wachsender Bedarf an der Entwicklung neuer Endpunkte, die in Teststrategien einbezogen werden sollen. Ziel dieser Dissertation war es, die Sensitivität und Anwendbarkeit der Integration von Proteomics in den konventionellen Fisch-Kurzzeit-Reproduktionsassay (FSTRA, OECD 229) zu demonstrieren, um Veränderungen an apikalen Endpunkten nicht nur mit den entsprechenden zugrunde liegenden molekularen Veränderungen zu verknüpfen, sondern auch Kandidaten für eine Diskriminierung von Hepatotoxizität und endokrin bedingter Toxizität. Um die Konsistenz der Stoffbewertung zu gewährleisten und weitere umfangreiche Tests zu verhindern, ist die Entwicklung eines zusätzlichen, informativen Ansatzes zur Unterscheidung zwischen Auswirkungen von Hepatotoxizität und endokrin modulierten Wirkungen für die Industrie und die regulativen Behörden von erheblicher Bedeutung. Zu diesem Zweck wurde eine FSTRA gemäß OECD TG 229 mit einer bekannten hepatotoxischen Substanz (Acetaminophen, APAP) und einer endokrin wirkenden Chemikalie (EDC, Fadrozol) durchgeführt. Fadrozol ist ein Medikament gegen Brustkrebs, das als nichtsteroidaler Aromatasehemmer wirkt und die Östrogensynthese spezifisch hemmt. APAP, ein nicht-steroidales entzündungshemmendes Medikament, ist eines der am häufigsten verwendeten rezeptfreien Medikamente gegen Schmerzen und Fieber, wenn es in der empfohlenen therapeutischen Dosis eingenommen wird. Bei hohen Konzentrationen wurde festgestellt, dass die Substanz Cyclooxygenaseenzyme hemmt und schwere Leberschäden verursacht. Die Wirkungen dieser beiden Substanzen wurden bei exponierten männlichen und weiblichen Zebrafischen getrennt ermittelt. Während der 21-tägigen Durchführung des Tests wurden die Auswirkungen der Substanzen auf die Fischreproduktion täglich und quantitativ unter allen in diesen Studien verwendeten Bedingungen gemessen. Am Ende des Tests wurden bei beiden Geschlechtern eine histopathologische Untersuchung von Gonaden und Lebern, die Expression von Hyaluronsäure zum Nachweis von Lebertoxizität und die Expression von VTG, einem bekannten Indikator für eine Störung des endokrinen Fortpflanzungsvermögens, gemessen. Darüber hinaus konzentrierte sich diese Studie auf die Wechselbeziehung zwischen Leberfunktionsstörungen und endokrinen Fortpflanzungsstörungen. Dazu wurden proteomische Techniken angewendet, um organspezifische Veränderungen der Proteinexpression zu identifizieren. Die beiden in dieser Studie untersuchten Substanzen zeigten einen starken Einfluss auf die Fortpflanzungsfähigkeit von Zebrafischen. Für die Behandlung mit Fadrozol wurden eine konzentrationsabhängige Abnahme der Eizahl, eine Abnahme der Plasma-VTG-Konzentrationen und eine milde Oozytenatresie mit Oozytenmembranfaltung bei den Weibchen festgestellt. In Übereinstimmung mit diesen apikalen Effekten zeigten die Proteommessungen ein signifikantes Defizit in der Östrogensynthese und eine gestörte Bindung von Sperma an die Zona pellucida im Eierstock. Die Exposition gegenüber APAP führte zu einer signifikanten Abnahme der Eizahl, einem Anstieg der Plasma-Hyaluronsäure-Konzentration und dem Vorliegen einer Einzelzellnekrose in den Hepatozyten. Interessanterweise ergab eine funktionelle Anreicherungsanalyse eine starke Störung der Leberfunktion, die von einer Stressinduktion im endoplasmatischen Retikulum über eine gestörte Mitochondrienfunktion, einer Glutathion-Dysregulation bis hin zu einer übermäßigen Anreicherung reaktiver Sauerstoffspezies reicht. Mitochondrienstörungen, die auf ein gestörtes oxidatives Phosphorylierungssystem zurückzuführen sind, wurden häufig in den Lebern und Gonaden exponierter männlicher und weiblicher Zebrafische festgestellt, was auf Leberschäden hinweist. Dies zeigte, dass APAP-induzierte Veränderungen der Fortpflanzungsfunktionen von Zebrafischen auf die beobachteten Störungen in den Hepatozyten und nicht auf eine Funktion des Östrogenmangels zurückgeführt werden konnten. Im Vergleich zur Exposition gegenüber Fadrozol wurden drei potenzielle Biomarker zur Identifizierung der Lebertoxizität, d. h. cahz, c3a.1 und atp5f1b, identifiziert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Integration der quantitativen Proteomics in den Weight-of-Evidence-Ansatz die Differenzierung von hepatotoxischen und endokrin wirkenden Substanzen signifikant verbessern könnte. Die beobachteten potenziellen Biomarker können weiter untersucht und als Ausgangspunkte für den Nachweis und die Priorisierung von hepatotoxischen Substanzen verwendet werden. In der Praxis wird dieser Ansatz die Entwicklung einer Biomarker-Datenbank fördern, die zur Gefahrenermittlung in der EU-Gesetzgebung und zur Entscheidung über die Option zur Risikobewertung erforderlich ist. Zusammengenommen zeigt diese Studie die Sensitivität und Durchführbarkeit der Integration geschlechtsspezifischer Proteomantworten zur Identifizierung bestimmter chemischer Ziele in Fischen. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse liefern signifikante Belege für die Verwendung eines Proteomics-Ansatzes als Strategie zur Gefährdungscharakterisierung für die Verknüpfung chemisch induzierter molekularer Veränderungen mit phänotypischen Veränderungen bei EDC-Tests.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Umweltbiologie und -chemodynamik [162710]