Advancing automated bioprocess development for industrial platform organisms

Jansen, Roman Pascal; Oldiges, Marco (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor); Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)

Aachen (2020, 2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Die industrielle Biotechnologie wird oft durch lange Prozessentwicklungszeiten behindert. Deshalb sind Methoden die beschleunigte Prozessentwicklung erlauben von großem Interesse. Automatisierung, Miniaturisierung und Parallelisierung haben sich dabei als wertvolle Werkzeuge erwiesen, da mehrere integrierte Mikrobioreaktor (MBR)-Plattformen entwickelt wurden, die einen erhöhten Durchsatz für die quantitative Phänotypisierung ermöglichen. Jedoch liegen noch diverse Limitierungen bei den Robotiksystemen vor, wenn man versucht manuelle Laborworkflows zu automatisieren. Deshalb werde neue Workflows in dieser Arbeit entwickelt, die die automatisierte Prozessentwicklung für diverse Plattformorganismen vorantreiben. MBR-Systeme sind für Hefen und bakterielle Mikroorganismen als auch für Batch-Kulturen gut etabliert. In der Industrie werden jedoch häufig Fed-Batch-Prozesse bevorzugt, z.B. um Sauerstofflimitierungen und Substratüberschussinhibierung zu vermeiden. Diese Diskrepanz zwischen Batch-Screening und Fed-Batch-Prozesszielen könnte zur Auswahl falscher Stämme und Parameter führen. Zwei Ansätze für den miniaturisierten Fed-Batch-Prozess wurden entwickelt und für den proteinproduzierenden C. glutamicum als Modellorganismus validiert. Es wurde ein feedback-reguliertes enzym-basiertes slow-release System für die Fed-Batch-Kultivierung in Mikrotiterplatten (MTP) entwickelt, das eine reproduzierbare einseitige pH-Kontrolle sowie eine konstante, lineare oder exponentielle Fütterung für 48 parallele Kultivierungen ermöglicht. Darüber hinaus wurde ein Workflow, basierend auf Mikrofluidik-MTPs, etabliert, der durch spezifisches Medium- und Feed-Lösungsdesign miniaturisierte Fed-Batch-Kulturen als Stand Alone-Lösung ermöglicht. Filamentöse Pilze der Gattung Aspergillus sind eines der Arbeitspferde für industrielle Produktionsprozesse. Allerdings wurden sie bisher aufgrund ihrer anspruchsvollen Morphologie nicht vollständig auf den Roboterplattformen implementiert. Neue Arbeitsabläufe, die eine robuste und reproduzierbare MBR-Kultivierung von mikrofilamentösen A. niger, Myzel-Aggregaten von A. giganteus und Pellets von A. carbonarius ermöglichen, wurden etabliert und validiert. Mit maßgeschneiderten Liquid-Handling-Parametern für die Pilzbiomasse wurde eine automatisierte Probennahme und -verarbeitung ermöglicht. Darüber hinaus wurde ein Workflow entwickelt, der eine automatisierte Morphologie-Analyse ermöglicht. Mit der erfolgreichen Implementierung von mikroskaligen Fed-Batch-Workflows und der Handhabung von Nicht-Standard-Mikroorganismen kann eine Vielzahl von biologischen Fallstudien durchgeführt werden. Insbesondere bei der Kombination der neuartigen Workflows sind neue Möglichkeiten der quantitativen Phänotypisierung möglich, z.B. die automatisierte Morphologie-Analyse aus Fed-Batch-Kultivierung zum Nachweis der Sporenbildung unter Kohlenstofflimitierung. Folglich bleiben Automatisierung, Miniaturisierung und Parallelisierung leistungsfähige Werkzeuge, um die Entwicklung von Bioprozessen zu beschleunigen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]