Chiral separation of arginine based on tailor-made FhuA β-barrel protein

Anand, Deepak; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Böker, Alexander (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2020, 2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Die Chiralität chemischer Verbindungen ist in der Natur allgegenwärtig und spielt eine zentrale Rolle im Stoffwechsel vieler Nährstoffe und Pharmazeutika. Obwohl Enantiomere einer Verbindung ähnliche chemische und physikalische Eigenschaften aufweisen, können sie eine völlig unterschiedliche biologische Aktivität aufweisen. Daher sind chirale Moleküle in der chemischen, pharmazeutischen und Lebensmittelindustrie von großem wirtschaftlichem Wert. Viele Anwendungen in diesen Industrien erfordern die Isolierung und Verwendung einzelner chiraler Isomere (Enantiomere) von chiralen Verbindungen. Infolgedessen besteht ein immer größerer Bedarf an optisch reinen Verbindungen. Die Deckung dieses Bedarfs an optisch reinen Enantiomeren ist stellt eine zentrale Herausforderung in der biotechnologischen Industrie dar. Seit der ersten optischen Auflösung von Weinsäure, die Louis Pasteur Anfang 1848 durchführte, wurden verschiedene Techniken für die chirale Auflösung von Enantiomerenverbindungen entwickelt. Verfahren wie chromatographische oder enzymatische Techniken werden üblicherweise verwendet. Sie sind jedoch durch Schwierigkeiten bei Großproduktionen begrenzt. Die Kristallisation kann in großem Maßstab eingesetzt werden, häufig sind jedoch mehrere Kristallisations- und Rekristallisationsrunden erforderlich, um enantiomerenreine Verbindungen zu erhalten, da das unerwünschte Enantiomer während des Kristallwachstums eingeschlossen ist, was häufig zu einer signifikanten Verringerung der Ausbeuten führt (bis zu 50%).Jede dieser Techniken hat ihre eigenen Vor- und Nachteile, wobei der membranbasierte Ansatz aufgrund seiner Verwendung im Dauerbetrieb und seiner einfachen Skalierbarkeit von besonderem Interesse ist. Das Problem mit der bisher entwickelten membranbasierten Technologie ist jedoch die ungleichmäßige Porengröße, sowie die begrenzte Anzahl von Poren. Von der Natur inspiriert, können membranbasierte Ansätze zur chiralen Trennung unter Verwendung eines Barrel-Proteins eine geeignete Alternative sein. Chirale Protein-Polymer-Membranen wären eine attraktive, kostengünstige und skalierbare Methode. Die Hauptherausforderungen liegen jedoch im Design von "Filterregionen" und der Erzeugung von "Screeningsystemen" zur Identifizierung von chiralen Kanalproteinen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Eisenhydroxamat-Aufnahmekomponente A (FhuA) so konstruiert, dass ein chiraler Kanal zur Trennung von Arginin-Enantiomeren erzeugt wird, der als Gerüst für die Erzeugung einer Protein-Polymer-Membran verwendet werden kann. FhuA ist ein großes monomeres Transmembranprotein von Escherichia coli, das sich zu einem Zylinder faltet, der aus 22 antiparallelen β-Strängen und einer tonnenverschließenden "Korkdomäne" besteht. FhuA wurde aufgrund seiner hohen Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln, seiner Wärmebeständigkeit und seiner hohen Robustheit gegenüber Reengineering Ansätzen, als funktionelle Nanopore ausgewählt. Strukturell enthält FhuA einen Wasserkanal, in dem zwei flexible Schleifen in der Korkdomäne (Schleife 1; Rest 35-40 und Schleife 2; Reste 135-145) verkürzt wurden, um zwei Selektivitätsfilterbereiche (Filter 1 und Filter 2) zu erzeugen. Zusätzlich wurde die Korkdomäne innerhalb des Fasses durch Substitution von drei Aminosäuren (Q62D, R81W und N117L) stabilisiert, was zur Erzeugung einer FhuA∆L-Variante mit einer höheren Wechselwirkung zwischen Fass und Korkdomäne führte. Um eine chirale selektive Variante zu erzeugen, wurde ein gerichtetes Evolutionsprotokoll entwickelt, um eine chirale FhuA∆L-Variante zu erzeugen. Ein neues kalorimetrisches Ganzzell-Screeningsystem auf der Basis eines Aminosäuren-umsetzenden Enzyms (Arginin-Deiminase) wurde entwickelt, um die enantioselektive Variante aus mutierten Bibliotheken von FhuA∆L zu identifizieren. Das Screening von Mutantenbibliotheken führte zur Identifizierung der FhuAF4-Variante (Aminosäuresubstitutionen: G134S, G146T), die einen ungefähr zweimal höheren Transport von L-Arginin im Vergleich zu Eltern-FhuA∆L mit E-Wert = 1,92 zeigte; ee% = 23,91 bei 52,39% Umwandlung. Gesteuerte Molekulardynamik (SMD) wurden simuliert, um das molekulare Verständnis der beobachteten veränderten Enantiopreferenz der FhuAF4-Variante gegenüber L-Arginin im Vergleich zur FhuA∆L-Variante zu verstehen. In der FhuA∆L-Variante wurden weniger Wechselwirkungen von D- und L-Arginin mit der Filterregion 2 beobachtet und beide Enantiomere passieren frei. Interessanterweise wird in der FhuAF4-Variante der Transport von D-Arginin behindert und der gesteuerte Transport verlangsamt, was durch eine längere Verweilzeit nahe dem Selektivitätsfilterbereich 2 angezeigt wird. Die erhaltenen Ergebnisse liefern einen ersten Beweis für das Prinzip der Konstruktion eines Membranproteins zur chiralen Trennung von Aminosäuren und geben einen Einblick in den Mechanismus der chiralen Trennung innerhalb des FhuA-Kanals. Es ist wahrscheinlich, dass mit der identifizierten Filterregion und den OmniChange-Bibliotheken weitere Verbesserungen für andere Aminosäuren und ein breiteres Spektrum von Enantiomeren erzielt werden könnte. Die chiralen FhuA-Kanalproteine wären ein hervorragendes Gerüst für die Erzeugung einer chiralen Membran auf der Basis von Proteinpolymerkonjugaten mit einem hohen Potenzial für neuartige und skalierbare nachgeschaltete Prozesse in der Pharma- und Lebensmittelindustrie.

Einrichtungen

  • Fachgruppe Biologie [160000]
  • Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]

Identifikationsnummern

Downloads