Genetic platform for improved expression and secretion of enzymes and antimicrobial peptides

Wei, Long; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Elling, Lothar (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2020, 2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Enzyme sind biologische Katalysatoren, die von lebenden Organismen produziert werden. Ihre Eigenschaften machen sie für viele verschiedene Forschungsgebiete und industrielle Anwendungen unverzichtbar. Für die Verwendung und die wissenschaftliche Analyse von Enzymen ist es von großer Bedeutung, ausreichende Mengen bereitstellen zu können. Die heterologe Produktion von Enzymen ist eine verbreitete Methode, um hohe Enzymtiter zu erreichen. Durch den Einsatz von Sekretion kann dabei die Ausbeute verbessert und der Umfang nachgelagerter Prozessschritte verringert werden. Es war das Ziel der vorliegenden Arbeit, eine Plattform für die Enzymproduktion zu etablieren, die dazu genutzt werden kann, die Expression und Sekretion von Enzymen auf einfache Art zu optimieren. Es sollte dementsprechend eine Fusionsplattform für Signalpeptidbibliotheken erstellt werden, die zum Durchmustern nach passenden Signalpeptiden verwendet werden kann. Zu diesem Zweck wurde eine Klonierungsstrategie etabliert, welche eine effiziente und schnelle Bibliothekserstellung ermöglicht. Darauffolgend wurde eine Signalpeptidbibliothek mit Signalpeptiden von B. subtilis erstellt. Diese Bibliothek diente als Ausgangspunkt für die Subklonierung in verschiedene Vektoren und zur Erstellung von Fusionsbibliotheken ausgewählter Gene. Es wurden zwei Vektoren für die Subklonierung verwendet: Ein Vektor von C. glutamicum, um die Enzymproduktion in diesem Gram-positiven Bakterium zu ermöglichen, und ein weiterer Vektor, der das fluoreszierende Reporterprotein Pp1FbFP beinhaltet, welches die Überwachung der Proteinsekretion während des Expressionsprozesses ermöglicht. Eine Cutinase, eine Phytase und eine Diguanylatcyclase wurden in die Bibliothek kloniert, um ihre Anwendbarkeit zu prüfen. Im Fall der Cutinase konnte durch das Durchmustern nach Signalpeptiden eine dreifache Verbesserung der Aktivität mittels des Signalpeptids YobB erreicht werden. Das beste Signalpeptid im Fall der Phytase AppA erbrachte eine 3,5-fache Verbesserung, verglichen mit der Ausgangsform. Im Fall der Diguanylatcyclase tDGCsh konnte keine Sekretion beobachtet werden. Nicht nur Enzyme sondern auch Peptide können durch die Fusion mit Signalpeptiden sekretiert werden. Die sekretorische Produktion von antimikrobiellen Peptiden in C. glutamicum wurde für die vier antimikrobiellen Peptide AFP1, LCI, Psoriasin und VarvF getestet. LCI und Psorasin konnten mit dem Signalpeptid NprE effizient sekretiert werden. Dabei wurden für LCI bzw. Psorasin Titer von bis zu 130 mg/L bzw. 54 mg/L erreicht. Zusätzlich zum Vorgenannten wurde mittels gerichteter Evolution die Sekretionseffizienz verschiedener Signalpeptide verbessert. Hierfür wurden die Signalpeptide PhrF und YbdN gewählt. Zwei Runden gerichteter Evolution resultierten in einer 2,4-fach erhöhten Aktivität für PhrF. YbdN zeigte nach einer Runde Mutagenese eine 1,36-fache Verbesserung. Die Koexpression von Enzymen mit zusätzlichen, nicht gebundenen Signalpeptiden resultierte in einer signifikanten Verbesserung der Enzymsekretion. Der Effekt von koexprimierten Signalpeptiden auf die Sekretion hing stark von den Expressionsbedingungen und dem jeweils verwendeten Signalpeptid ab. Um eine weitere Verbesserung der Enzymproduktion zu erreichen, wurde die Methode epMEGAWHOP für die Vektorrückgratevolution verwendet. Diese wurde auf den E. coli-Vektor pALXtreme-1a und auf den E. coli-C. glutamicum Shuttlevektor pEKEx2 angewendet. Die Aktivität des Modellenzyms Cutinase konnte dabei im Fall von pEKEx2 nach zwei Evolutionsrunden bis zu 2,5-fach verbessert werden, wohingegen im Fall von pALXtreme-1a nach drei Evolutionsrunden eine bis zu neunfache Verbesserung erreicht wurde.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]