Establishment and application of accelerated bioprocess development for filamentous organisms

• Entwicklung und Anwendung von beschleunigter Bioprozessentwicklung für filamentöse Organismen

Koepff, Joachim; Oldiges, Marco (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2020, 2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Filamentöse Organismen des Genus Streptomyces, sind wichtige Vertreter in industriellen Produktionsprozessen. Insbesondere ihre Fähigkeit eine große Vielfalt von bioaktiven Substanzen zu synthetisieren und ihre Produktionseffizienz für (heterologe) Proteine, hält sie sie schon seit Jahrzehnten im Fokus von Forschern und biopharmazeutischen Unternehmen. Es gibt bereits Methodiken und Praktiken zur genetischen Modifikation dieser Bakterien, die es erlauben, schnell und effizient große Stammbibliotheken zu entwickeln. Die anschließende Charakterisierung und das Screening dieser Mutanten oder die Entwicklung von geeigneten Produktionsprozessen stellt jedoch nach wie vor ein Hindernis dar. Um diese Herausforderung anzugehen, wurde ein umfassender Arbeitsablauf für Streptomyces lividans auf der Basis von kleinen (1000 Mikroliter) geschüttelten parallelisierten Mikrobioreaktoren entwickelt und validiert. Ausgehend von einer standardisierten Vorkultur konnten damit sehr reproduzierbare Ergebnisse ((CV) ≤ 3.2 %) für biologisch unabhängigen Chargen erzeugt werden. Auch im Vergleich zu etablierten Laborreaktorsystemen mit 1000-fach größerem Arbeitsvolumen wurden ein sehr vergleichbares Kultivierungsverhalten beobachtet, welches durch Transkriptom- und Proteomanalysen weiter untermauert werden konnte. Bemerkenswerterweise stellte sich das optische, biomasse-abhängige Streulichtsignal als wertvolle Messgröße heraus, die es ermöglicht verlässliche Informationen über den aktuellen Kultivierungszustand (z.B. maximale spezifische Wachstumsrate, Chargendauer) abzuleiten. Darüber hinaus konnten spezifische Methoden entwickelt, validiert und genutzt werden, um weitere wertvolle Messgröße abzuleiten, darunter roboter-gestützte Zelltrockenmassebestimmung und automatisierte Morphologieanalyse. Das geringe verfügbare Arbeitsvolumen, sowie die speziellen Eigenschaften der filamentösen Organismen stellten dabei die größte Herausforderung dar. Der entwickelte Ablauf zur beschleunigten Stammcharakterisierung wurde anschließend auch für weitere filamentösen Organismen angewandt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Methodiken direkt auf den nahen Verwandten Streptomyces fradiae übertragbar sind und es sogar für den filamentösen Pilz Trichoderma reesei erlauben, nutzbare (wenn auch eingeschränkte) Informationen zu erzeugen. Außerdem konnten zwei Deletions-Stammbibliotheken von Streptomyces lividans hinsichtlich wachstums- und produktions-abhängigen Parametern phänotypisiert werden. Dies ermöglichte die Untersuchung der Funktion von relevanten σ-Faktoren sowie Proteasen dieses filamentösen Streptomyceten. Der entwickelte miniaturisierte und parallelisierte Ablauf scheint daher ein wertvolles und geeignetes Werkzeug zu sein, um industriell wichtige filamentöse Vertreter wie Streptomyceten zu charakterisieren und untersuchen. Die Ergebnisse dieser Arbeit tragen dazu bei, die industrielle Einsetzbarkeit solcher speziellen Organismen zu verbreitern und den technologischen Abstand zu ihren nicht-filamentösen Konkurrenten zu schließen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]