Targeting metalloproteinases ADAM10 and ADAM17 : Effects on ADAM protein expression and antibacterial defense

• Targeting der Metalloproteinasen ADAM10 und ADAM17: Effekte auf die ADAM Proteinexpression und die antibakterielle Abwehr

Seifert, Anke Carmen; Ludwig, Andreas (Thesis advisor); Elling, Lothar (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Indem sie eine große Anzahl von Proteinen, darunter Wachstumsfaktoren, Rezeptoren und Entzündungsmediatoren wie TNFα schneiden, tragen die Metalloproteinasen ADAM10 und ADAM17 entscheidend zur embryonalen Entwicklung, zu Krebs und zu Entzündungen bei. Verschiedene in vitro- und in vivo-Studien zeigten, dass ADAM10 und ADAM17 in akuten Entzündungsprozessen zellspezifische Funktionen ausüben. Aus diesem Grund wird eine Hemmung dieser Proteasen als möglicher therapeutischer Ansatz betrachtet. Durch die Freisetzung von Toll-like-Rezeptoren und Scavenger-Rezeptoren können ADAM10 und ADAM17 möglicherweise auch die angeborene Immunabwehr gegen Mikroorganismen beeinflussen. Daher ist es von Bedeutung, die Regulation von ADAM10 und ADAM17 vollständig zu verstehen und alle möglichen Konsequenzen des spezifischen Hemmungsansatzes zu kennen. Es ist bekannt, dass die niedermolekularen Inhibitoren GI254023X und TAPI-1 die Aktivität von ADAM10 bzw. ADAM17/ADAM10 schnell und effizient hemmen. Die langfristigen Effekte der Inhibitoren auf die Proteasen und ihre Wirkung auf die bakterielle Phagozytose, die einen entscheidenden Schritt in der angeborenen Immunabwehr darstellt, sind jedoch unbekannt. Daher war das erste Ziel der vorliegenden Studie, die Konsequenzen einer Langzeitbehandlung mit Inhibitoren auf die Expression von ADAM10 und ADAM17 in vitro und in vivo zu untersuchen. Das zweite Ziel bestand darin, die Auswirkungen der Proteasen auf die bakterielle Phagozytose durch kultivierte murine und humane Phagozyten zu analysieren. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der Verlust der proteolytischen Aktivität von ADAM10 durch Inhibitoren oder durch eine Mutation in der katalytischen Domäne die Entfernung der Protease von der Zelloberfläche und der gesamten Zelle induziert. Dieser Prozess war temperaturabhängig, auf matures ADAM10 beschränkt und mit erhöhter Internalisierung, lysosomalem Abbau und Freisetzung von maturem ADAM10 in extrazellulären Vesikeln verbunden. Die Erholung von dieser Depletion erforderte eine de-novo-Synthese von ADAM10. Funktionell spiegelte sich dies im Verlust und in der darauf folgenden Wiederherstellung der ADAM10-Substratumsetzung wider. Darüber hinaus führte eine GI-vermittelte ADAM10-Hemmung zur Reduzierung von systemischem ADAM10 in verschiedenen Geweben von Mäusen. Es kann daher geschlussfolgert werden, dass die ADAM10-Aktivität für dessen Oberflächenexpression in vitro und in vivo von entscheidender Bedeutung ist. Im zweiten Teil dieser Studie wurden mehrere Belege dafür erbracht, dass die physiologische Expression von ADAM17 in Phagozyten die bakterielle Aufnahme abschwächt. Die Hemmung der Metalloproteinase-Aktivität von ADAM17 führte zu einer verstärkten Phagozytose von pHrodo-markierten, gramnegativen und grampositiven Bakterien (E. coli bzw. S. aureus) durch humane und murine monozytäre Zelllinien und primäre Phagozyten. Aus murinem Knochenmark isolierte Makrophagen zeigten eine erhöhte Aufnahme von hitzeinaktivierten und lebenden E. coli Bakterien, wenn ihnen entweder ADAM17 oder das Adapterprotein iRhom2 fehlte, dass für die ADAM17-Reifung erforderlich ist, nicht jedoch, wenn sie eine Defizienz von ADAM10 aufwiesen. In monozytären THP-1-Zellen bestätigte eine entsprechende shRNA-vermittelte Herrunterregulation, dass Reduzierung von ADAM17, nicht aber von ADAM10 die Phagozytose von E. coli förderte. Die vermehrte bakterielle Aufnahme erfolgte zellautonom und ging mit einer erhöhten Freisetzung des Chemokins CXCL8 einher. Hemmungsexperimente wiesen darauf hin, dass die verstärkte bakterielle Phagozytose nach Herrunterregulation von ADAM17 teilweise von der Aktivität von TNFα abhängig war. Für die weitere Entwicklung von Hemmstrategien für ADAM-Proteasen muss daher berücksichtigt werden, dass die Inhibition von ADAM10 zu einer langfristigen Herabregulation der ADAM10-Oberflächenexpression führt und dass die Hemmung von ADAM17 die bakterielle Phagozytose fördert. Diese Arbeit kann weitere Studien anregen, die untersuchen, ob die beobachtete Oberflächenregulation auch für andere Proteasen als ADAM10 gilt und ob eine Hemmung von ADAM17 die bakterielle Phagozytose in vivo verbessern würde.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]
• [528500-2]