Directed evolution of decarboxylase OleT and nitrobindin hybrid catalysts

• Gelenkte Evolution der Decarboxylase OleT und von Nitrobindin-Hybridkatalysatoren

Markel, Ulrich; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Okuda, Jun (Thesis advisor)

Aachen (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Gelenkte Evolution ist eine leistungsfähige Methode, um Enzyme speziell für unsere Bedürfnisse zu entwickeln. In dieser Arbeit wurde die gelenkte Evolution von natürlichen und künstlichen Metalloenzymen (ArMs; auch bekannt als Biohybridkatalysatoren), die Porphyrin-basierte Katalysatoren enthalten, erfolgreich demonstriert. Im ersten Teil wurde ein Hochdurchsatzdurchmusterungs (HTS)-Assay für Decarboxylasen entwickelt. Bisher war kein HTS-Assay für OleT oder andere Decarboxylasen verfügbar, weshalb diese wichtige Gruppe von Enzymen noch keinen Zugang zu Hochdurchsatz-Protein-Engineering-Strategien hatte. Unter Verwendung eines Diaryltetrazols als photoklickbarer Farbstoff wurde ein robuster 96-Well-Photoklick-Assay für Decarboxylasen entwickelt. Der Assay ist nicht auf Modellsubstrate angewiesen und detektiert Styrolderivate quantitativ im mikromolaren Bereich. In einer gelenkten Evolutionsstudie wurde der Assay angewandt, um die Substratspezifität des langkettige Fettsäuren bevorzugenden OleT-BM3R-Fusionsenzyms so zu verändern, dass es nicht-natürliche aromatische Substrate bevorzugt umsetzt. Es wurden zwei Enzymvarianten mit signifikant veränderter Substratpräferenz identifiziert (F79V und F79L). Der vorgestellte, auf Photoclick-Chemie basierende HTS-Assay hat potentielle Auswirkungen für die gelenkte Evolution von OleT und anderen Decarboxylasen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden ArMs, die Porphyrin-Derivate enthalten, erfolgreich konstruiert. Zunächst wurde die chemogenetische Evolution eines Peroxidase-ähnlichen ArMs demonstriert. Nitrobindin 4 (NB4) mit seinem hydrophoben Kavitäts-Design stellte in dieser Hinsicht einen idealen, evolutionär naiven Ausgangspunkt dar: Es ermöglichte die Identifizierung der wichtigen distalen R76-Aminosäure - einer Aminosäure, die ausgehend von Wildtyp-Nitrobindin, aufgrund des Wasserstoffbrückenbindungskontextes in dessen Kavität, nicht zugänglich ist. Darüber hinaus ermöglichte der offene Hohlraum des NB4-Gerüsts eine Peroxidase-ähnliche Aktivität gegen eine breite Palette von Substraten unter Verwendung von Peressigsäure (AcOOH) als Oxidationsmittel. Gängige Redox-Mediatoren wurden mit Aktivitäten umgesetzt, die die von früheren ArMs übertreffen und mit denen von natürlichen Peroxidasen konkurrenzfähig sind. Darüber hinaus wurden drei hartnäckige Farbstoffe durch die ArMs zügig entfärbt. Zusätzlich führte die Kombination des MnPPIX-Cofaktors und Varianten des NB4-Gerüsts zu einer künstlichen Epoxygenase. Mechanistische Untersuchungen mittels UV/Vis-Spektroskopie deuten darauf hin, dass der katalytische Zyklus über eine Mn(V)=O und/oder [Mn(IV)=O]^+• Spezies abläuft. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der pH-Wert und der proximale Histidin-Ligand eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung von H₂O₂ spielen. Die Kombination der ArMs mit Glucoseoxidase in einer Kaskadenreaktion ermöglichte schließlich die direkte Verwertung von molekularem Sauerstoff aus der Luft.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]