Engineering of biocatalytic microgels and bifunctional peptides for biohybrid systems

• Engineering von biokatalytischen Mikrogelen und bifunktionalen Peptiden für biohybride Systeme

Nöth, Maximilian Wolfgang Stefan; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Pich, Andrij (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021, 2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Biohybride Materialien und Systeme bieten großes Potenzial für die Biokatalyse und Materialwissenschaften, da die Kombination von biologischen und synthetischen Bausteinen das Design von neuartigen funktionalen biohybriden Katalysator- und Materialkonzepten ermöglicht. Für die Entwicklung neuer biohybrider Materialien und Systeme werden neue Strategien zur Integration von biokatalytischen Funktionalitäten in Materialien und zur Material- und Oberflächenfunktionalisierung benötigt. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei neuartige biohybride Systeme für die Biokatalyse sowie die universelle Funktionalisierung von Materialien und Oberflächen entwickelt: Das erste Kapitel befasst sich mit der Immobilisierung der Cytochrom P450 BM3 Monooxygenase in stimuliresponsiven "smarten" Mikrogelen (P450 μ-Gelzyme), während das zweite Kapitel die Entwicklung eines Werkzeugkastens für die universelle Oberflächenfunktionalisierung von synthetischen Polymeren, Metallen und siliziumbasierten Materialien, auf Basis bifunktionaler Peptide, umfasst. Enzyme sind von der Natur entwickelte Biokatalysatoren die (bio)chemische Reaktionen unter umweltfreundlichen Reaktionsbedingungen mit beeindruckenden Chemo-, Regio- und Stereoselektivitäten durchführen können. P450 Monooxygenasen sind vielseitige Biokatalysatoren, die über ein hohes synthetisches Anwendungspotenzial verfügen, deren Nutzung jedoch, unter anderem, durch ihre geringe Stabilität unter Anwendungsbedingungen erschwert wird (z. B. geringe Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln, Inaktivierung nach einer bestimmten Reaktionszeit). Die Enzymimmobilisierung ist eine der erfolgreichsten Strategien, um die Stabilität von Enzymen zu verbessern und ermöglicht darüber hinaus die Freisetzung, die erneute Immobilisierung und das Recycling von Enzymen. P450 Monooxygenasen sind schwierig zu immobilisieren. Im Fall von P450 BM3, aus Bacillus megaterium, ist die Aktivität nach der Immobilisierung oft beeinträchtigt oder geht ganz verloren. Als eine innovative Klasse von Trägermaterialien für die Enzymimmobilisierung haben stimuliresponsive und "smarte" Mikrogele Aufmerksamkeit erregt, da sie über chemische und mechanische Stabilität, anpassbare Architektur, Biokompatibilität, Porosität und einen hohen Wassergehalt verfügen. Darüber hinaus ermöglichen Mikrogele hohe Enzymbeladungen und bieten eine schützende Umgebung für die immobilisierten Enzyme. Neue Strategien zur Integration von Enzymen in Mikrogelen und neue Mikrogelsysteme müssen entwickelt werden, um das Potenzial von stimuliresponsiven Mikrogelen als Plattform für die Immobilisierung von "sensitiven", schwierig zu immobilisierenden Enzymen zu nutzen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte P450 BM3 zum ersten Mal ohne Verlust der katalytischen Aktivität und unabhängig vom pH-Wert in einem neuen Typ von Poly(N-Vinylcaprolactam) Mikrogelen, die über 1-Vinyl-3-Methylimidazolium als Comonomer verfügen, immobilisiert werden (biohybride P450 μ-Gelzyme). Darüber hinaus wurden die Leistungsfähigkeit der biohybriden P450 μ-Gelzyme zum ersten Mal systematisch untersucht. Die positive und pH-unabhängige Ladung der Poly(N-Vinylcaprolactam) Mikrogele wurde durch Quaternisierung der 1-Vinylimidazol Comonomere ermöglicht (1-Vinyl-3-Methylimidazolium). Durch die pH-unabhängige Immobilisierung konnten die biohybriden P450 μ-Gelzym Katalysatoren im pH-Aktivitätsoptimum genutzt werden (pH 8). Darüber hinaus ermöglichten die P450 μ-Gelzyme die durch Ionenstärke steuerbare Freisetzung und erneute Immobilisierung von P450 BM3, sowie das Recycling des Biokatalysators und boten erste Schutzwirkungen gegen organische Lösungsmittel. Die biologische Transformation der Materialwissenschaften ebnet durch die Kombination und Integration von biologischen und synthetischen Bausteinen in Materialien (z. B. Biofunktionalisierung von synthetischen Polymeren, Metallen und siliziumbasierten Materialien) den Weg zu neuartigen biohybriden Materialkonzepten. Voraussetzungen für die biologische Transformation der Materialwissenschaften sind universell einsetzbare und spezifische Methoden für die Funktionalisierung von Materialien und Oberflächen. Diese sind stellen aber aufgrund der sehr unterschiedlichen Eigenschaften von Materialien und Oberflächen eine zentrale Herausforderung dar. Um diese Kernherausforderung zu lösen, müssen innovative Technologien für die Material- und Oberflächenfunktionalisierung entwickelt werden. Die biologische Oberflächenfunktionalisierung mit Materialbinde- oder Ankerpeptiden ermöglicht die einfache Ausrüstung von Materialen mit biologischen und synthetischen Funktionalitäten und ist eine energieeffiziente und umweltfreundliche Alternative zu chemischen und physikalischen Oberflächenfunktionalisierungsstrategien. Basierend auf diesem Konzept wurde ein neuartiger Werkzeugkasten für die universelle Material- und Oberflächenfunktionalisierung, basierend auf bifunktionalen Peptiden, entwickelt. Bifunktionale Peptide wurden durch sortasevermittelte Ligation unter Verwendung von Sortase A aus Staphylococcus aureus synthetisiert. Im Detail wurde das universelle Ankerpeptid LCI aus Bacillus subtilis mit verschiedenen Aminfunktionalitäten modifiziert (z. B. reaktive Gruppen für Click-Chemie, Fluoreszenzfarbstoffe, Antibiotika, synthetische Polymere). Die sortasevermittelte Ligation ermöglichte darüber hinaus die Aufreinigung der bifunktionalen Peptide durch eine Negativ-Reinigungsstrategie mittels Strep-tag II-Affinitätschromatographie (Reinheit > 90 %). Der Werkzeugkasten ermöglichte, basierend auf bifunktionalen Peptiden, die Funktionalisierung von Oberflächen entweder durch eine Zwei- oder eine Einschrittstrategie. Im Fall der Einschrittstrategie wurde LCI direkt mit der gewünschten Funktionalität ausgerüstet, während im Fall der Zweischrittstrategie LCI mit einer reaktiven Gruppe modifiziert wurde, die eine weitere Funktionalisierung ermöglichte (z. B. durch Click-Chemie). Bei der Zweischrittstrategie wurden synthetische Polymere (Polypropylen, Polyethylenterephthalat), Metalle (Edelstahl, Gold) und Silizium mit reaktiven Gruppen für die kupferfreie Azid-Alkin Click-Chemie funktionalisiert. Die Anwendbarkeit der Einschrittstrategie wurde durch die direkte Funktionalisierung von Polypropylen mit einem Fluoreszenzfarbstoff und Biotin demonstriert. Insgesamt repräsentieren diese Ergebnisse die erste systematische Kombination von universellen Ankerpeptiden, wie LCI, und sortasevermittelter Ligation in einem universellen Oberflächenfunktionalisierungswerkzeugkasten, einschließlich der ersten peptidvermittelten Funktionalisierung von Polypropylen und Polyethylenterephthalat mit reaktiven Gruppen für die kupferfreie Azid-Alkin Click-Chemie.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]