Combination and immobilization of enzyme module systems for the synthesis of hyaluronic acid

• Kombination und Immobilisierung von Enzymmodulsystemen zur Synthese von Hyaluronsäure

Gottschalk, Johannes; Elling, Lothar (Thesis advisor); Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021, 2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Diese Arbeit zielte darauf ab, eine Eintopfsynthese zu etablieren, die nicht nur die benötigten UDP-Zucker, sondern auch HA mit hohem Molekulargewicht und geringer Dispersität produziert. Dafür musste eine neues EM UDP-GlcA integriert werden. Das EM UDP-GlcA enthält die Enzyme AtGlcAK, AtUSP und PmPpA. Alle Enzyme in dieser Arbeit wurden erfolgreich in E. coli exprimiert und konnten mit IMAC gereinigt werden. Die neuen Enzyme wurden hinsichtlich ihrer kinetischen Parameter sowie optimalen Bedingungen charakterisiert. Insbesondere die Substratinhibierung von AtGlcAK und die Aktivitätssteigerung durch K+ waren neue Erkenntnisse für diese pflanzliche Glucuronokinase. In dieser Arbeit wurde die erste Charakterisierung von PmPpA durchgeführt und auch hier wurde eine Substratinhibierung nachgewiesen. Die Cofaktor-, pH- und Temperaturoptima wurden untersucht, mit dem Ergebnis, dass diese drei Enzyme kompatibel sind. Das EM UDP-GlcA schnitt mit einer UDP-GlcA-Ausbeute von 84 % nach 1 h sehr gut ab. Da AtGlcAK das Geschwindigkeit bestimmende Enzym dieses EM ist, verbesserte die Hinzufügung von K+ auch die EM UDP-GlcA-Leistung. PmHAS1-703 wurde ebenfalls weiter analysiert und hier wurde die K+-Aktivierung bestätigt. Das EM UDP GlcA wurde zuerst mit dem EM HA kombiniert, wobei verschiedene Ausgangskonzentrationen von GlcA verwendet wurden. Dieses Experiment zeigte, dass für ein hohes MW von HA eine bestimmte GlcA-Konzentration erforderlich ist. Es war der erste Beweis in dieser Arbeit für die folgende Hypothese, die die meisten Ergebnisse hier begleitet. In früheren Studien, aber auch hier, kann die Aktivität von PmHAS1-703 mit der UDP-Zuckerkonzentration kontrolliert werden. Eine hohe UDP-GlcNAc-Konzentration und eine UDP-GlcA-Konzentration zwischen 6-8 mM führten zu einer hohen Aktivität von PmHAS1-703. Die Synthese von HA durch PmHAS1-703 muss in zwei Phasen unterteilt werden: De novo Synthese und Polymerisation. Es wurde gezeigt, dass die Polymerisation viel schneller ist als die De novo Synthese. Eine höhere Gesamtaktivität von PmHAS1-703 bedeutet, dass mehr Polymerisationen stattfinden und die endgültige HA-Größe größer ist. Diese Hypothese wurde bestätigt, als alle EMs zur Eintopfsynthese kombiniert wurden. Das MW von HA nimmt mit der Zeit allmählich zu. Ein früheres Stoppen der Reaktion führt zu einem maßgeschneiderten HA-Produkt, aber die Konzentration war relativ niedrig. Überraschenderweise hatten zwei weitere Schlüsselfaktoren, der pH-Wert und die MgCl2-Konzentration, einen großen Einfluss auf die UDP-Zuckersynthese. Beispielsweise führt ein pH-Wert von 8,5 oder 9 oder eine hohe MgCl2-Konzentration zu einer verstärkten UDP-GlcNAc und einer reduzierten UDP-GlcA-Synthese. Dies erhöht wiederum die Gesamtaktivität von PmHAS1-703 und das endgültige MW von HA. Mit 25 mM MgCl2 wurde ein durchschnittlicher HMW HA (1,54 MDa) mit geringer Dispersität (1,05) und hoher Konzentration (1,4 g L-1) hergestellt. Diese Ergebnisse entsprechen der Hypothese. Zusammenfassend wurden zwei leicht zu handhabende Schlüsselfaktoren gefunden, durch die das HA-Produkt maßgeschneidert werden kann, und die HA-Konzentration liegt im Grammbereich. Der nächste Schritt war die Integration eines NTP-Regenerationssystems. Das System PolyP/RpPPK2-3 wurde gewählt, da der Phosphatspender PolyP im Gegensatz zu anderen Phosphatspendern unter wässrigen Bedingungen stabil und günstig ist. Erstmals wurden kinetische Parameter für ADP bestimmt, mit dem Ergebnis, dass RpPPK2-3 eine höhere Affinität zu ADP zeigte als UDP. Die Implementierung von RpPPK2-3 in EM UDP-GlcA und EM UDP-GlcNAc zeigte, dass die Effizienz der ATP-Regeneration direkt von den angewendeten Kinasen abhängt. BlNaHK hat eine höhere Affinität zu ATP als AtGlcAK. Daher unterscheiden sich die Regenerationszahlen extrem (EM UDP-GlcA: 17; EM UDP GlcNAc: 234). Für beide EMs konnte jedoch die ATP-Menge verringert werden, und die Ausbeuten blieben unverändert. Für die Eintopf-Synthese musste die PolyP-Konzentration erhöht werden, was dazu führt, dass die UDP-GlcNAc-Synthese aufgrund der Metallionen-Komplexierung von PolyP stark reduziert wurde. Dies passt zu der Beobachtung, dass die UDP-GlcNAc-Synthese bei niedriger MgCl2-Konzentration reduziert wird. Die niedrigere UDP-GlcNAc-Konzentration verringerte die PmHAS1-703-Aktivität und gemäß der Hypothese wurden auch niedrigere MW von HA synthetisiert. Dennoch zeigte auch dieses Experiment, dass die UDP-Zuckerkonzentration auch mit der applizierten ATP-Konzentration gesteuert werden kann. Eine niedrige ATP-Konzentration verstärkt UDP-GlcNAc und verringert die UDP-GlcA-Synthese. Mit 0,1 mM ATP und 25 mM MgCl2 wurde HA mit einem durchschnittlichen MW von 1,17 MDa und einer Dispersität von 1,08 mit einer Konzentration von 0,8 g L 1 hergestellt. Die Regenerationszahl betrug 75. Mit diesem Experiment wurden die Möglichkeiten für die Synthese niedrigerer HMW HA erweitert. Anschließend wurden alle Enzyme nicht-kovalent über His-Tag und NTA-Ni2+-Linker auf magnetischen Kügelchen immobilisiert. Die Immobilisierung von Enzymen hatte einen enormen Einfluss auf die kinetischen Parameter der Enzyme. Insbesondere PmHAS1-703 zeigte eine höhere Affinität zu UDP GlcNAc und eine allgemein höhere Aktivität mit UDP-GlcA. Die repetitive Synthese von UDP-GlcA und UDP-GlcNAc mit ATP-Regeneration war erfolgreich. Es wurde jedoch eine signifikante Abnahme der Leistung festgestellt, die wahrscheinlich auf die mechanischen Kräfte zurückzuführen ist, denen die Enzyme ausgesetzt sind. Dennoch sollte gemäß der Hypothese eine höhere PmHAS1-703-Aktivität zu einem höheren MW von HA führen, und tatsächlich war in der Eintopfsynthese das durchschnittliche MW von HA im ersten Zyklus höher (3,6 MDa) und die Dispersität ist noch sehr niedrig (1,03). Die Konzentration (0,5 g L-1) war im Vergleich zu den löslichen Ansätzen niedriger. Aber auch hier schmälern die mechanischen Kräfte die Ergebnisse für weitere Zyklen. Zusammenfassend hat diese Arbeit erfolgreich gezeigt, dass die enzymatische Produktion von HMW HA mit geringer Dispersität möglich und kontrollierbar ist. Im Vergleich zu industriellen Verfahren wurden HA-Produkte mit höherer Qualität synthetisiert. Die Anwendung unterschiedlicher Bedingungen, entweder mit pH, MgCl2, ATP oder Immobilisierung, kann die UDP-Zuckersynthese und/oder die PmHAS1-703-Aktivität kontrollieren, die das endgültige HA-Produkt bestimmt. Diese Arbeit legt den Grundstein für zukünftige Studien zur In-vitro-Synthese von HA, um nicht nur qualitativ, sondern auch quantitativ mit herkömmlichen HA-Produktionen zu konkurrieren.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Biomaterialien [162820]