Model-based and rational design of plant purification processes

• Model basiertes und rationales Design von Reinigungsprozessen aus Pflanzen

Bernau, Catherine Rose; Buyel, Johannes Felix (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021, 2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Pflanzen bieten viele Vorteile für die Produktion von Biopharmazeutika. Dazu zählen die günstige und leicht skalierbare Aufzucht, post-translationalen Modifikation und fehlende Pathogene für Menschen. Allerdings kann die Produktaufarbeitung im Vergleich zu mikrobiellen und Zellkultursystemen aufgrund der niedrigen Produktkonzentration in der Pflanzenbiomasse und starke Verunreinigungen des Zielproteins durch Wirtszellproteine aufwendiger sein. Die Vorhersage der chromatographischen Trennung durch Modelle und das Wissen über das Elutionsverhalten von häufigen Verunreinigungen wie Wirtszellproteine kann die Anzahl an Prozessentwicklungsschritten reduzieren und so die Kosten senken. Einen wichtigen Teil solcher Modelle stellen Sorptionsisothermen, wie die steric mass action (SMA) Isotherme, dar. Diese beschreibt das Gleichgewicht von Protein und Salz bei Ionentauschern. Protein-spezifische Parameter der Isotherme können mit den jeweiligen Proteineigenschaften korreliert werden um Isothermenparameter von weiteren Proteinen vorherzusagen. Zur Bestimmung der protein-spezifischen Parameter muss das Protein in reiner Form vorliegen. Daher wurden in dieser Arbeit Reinigungsstrategien für neun Tabakwirtszellproteine (Nicotiana tabacum und N. benthamiana) entwickelt, die Proteine im präperativen und Pilotmaßstab gereinigt und eine Reinheit von min. 89%, mit Ausnahme des 20S Proteasoms (Reinheit 36%), sowie einer maximalen Ausbeute von 178x10-5 g g-1 (RuBisCO) erreicht. Des Weiteren, wurden 3 Halohydrindehalogenasen (HheA2, HheB2 und HheC) aufgrund der hohen strukturellen Ähnlichkeit zueinander, trotz gleichzeitig niedriger Sequenzidentität, in Escherichia coli exprimiert und anschließend gereinigt. Hier wurde eine maximale Reinheit von 79% und Ausbeute von 751x10-5 g g-1 für HheA2 erzielt. Außerdem wurden sieben kommerziell erhältliche Proteine für die Bestimmung von SMA-Parametern (charakteristische Ladung und Gleichgewichtskonstante) ausgewählt. Neben den reinen Proteinen wurden verschiedene Einflussfaktoren, die die Genauigkeit eines Vorhersagemodells des Elutionsverhaltens von Pflanzenwirtszellproteinen beeinflussen können, untersucht. Von diesen Einflussfaktoren zeigte die Charge des Chromatographieresins eine hohe Reproduzierbarkeit und damit einen geringen Einfluss und die pflanzenbasierten Einflussfaktoren eine hohe Varianz und damit eine Reduktion der Vorhersagekraft eines zukünftigen Modells. Der Einfluss des pH auf ν und Keq ist noch uneindeutig, aber aufgrund der signifikant höheren Streuung der SMA Parameter bei den verschiedenen pH-Werten verglichen zu wiederholten Messungen des gleichen Proteins bei konstantem pH, scheint ein Zusammenhang zu bestehen. Im Gegensatz dazu wurde ein indirekter Effekt durch hochmolekulare Aggregate aufgrund von beginnender Denaturierung auf den steirischen Faktor beobachtet. Darüber hinaus war der sterische Faktor von RuBisCO verglichen zu Literaturwerten anderer Proteine sehr hoch, dies könnte durch Größenausschlusseffekte durch die Größe von RuBisCO verursacht worden, welche nicht in dem verwendeten SMA Model repräsentiert sind. Die Analyse aller untersuchten Proteine ergab einen wahrscheinlichen Einfluss der Oberflächenladungsverteilung auf die charakteristische Ladung und Gleichgewichtskonstante. Final zur Ansatzüberprüfung für die Vorhersagbarkeit einer Multikomponentenelution durch Einzelproteinelutionen, wurde eine Gradientenelution mit einer Mischung aus vier Proteinen durchgeführt. Ein Vergleich der Elutionspeaks mit Vorhersagen durch SMA Parameter, die über Gradientenelutionsexperimenten von einzelnen Proteinen bestimmt wurden, zeigte eine hohe Übereinstimmung und damit die grundsätzliche Machbarkeit der Vorhersage durch Einzelproteinelutionen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Molekulare Biotechnologie [162910]