Functional analysis of the channel enzyme TRPM2 in vitro and in vivo : species-specific role of the NUDT9H domain and phenotypic characterization of a TRPM2 knockout of the model organism Nematostella vectensis

• Funktionale Analyse des Kanalenzym TRPM2 in vitro und in vivo : Speziesspezifische Rolle der NUDT9H Domäne und phänotypische Charakterisierung eines TRPM2 Knockout des Modelorganismus Nematostella vectensis

Ehrlich, Wiebke; Kühn, Frank (Thesis advisor); Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Die humane Speziesvariante des Ca2+ permeablen Kationenkanals TRPM2 (hsTRPM2) ist entscheidend an der durch oxidativen Stress induzierten Apoptose beteiligt, weshalb dieser Ionenkanal eine kritische Rolle bei einigen wichtigen pathophysiologischen Prozessen spielt. Die vergleichende Analyse von verschiedenen TRPM2-Orthologen aus Vertebraten bzw. Invertebraten ergab wertvolle Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehung von TRPM2. Das Vorhandensein einer C-terminalen Domäne (NUDT9H), abgeleitet von der humanen ADP-Ribose-Diphosphatase NUDT9, stellt ein einzigartiges Merkmal von TRPM2 dar und ist zumindest bei Vertebraten für die Funktion dieses Kanals entscheidend. Lange Zeit wurde angenommen, dass NUDT9H als einzige Bindungsstelle für den prinzipiellen TRPM2-Agonisten ADP-Ribose (ADPR) fungiert. Untersuchungen am TRPM2-Orthologen der Seeanemone Nematostella vectensis wiesen jedoch stark auf die Existenz einer zusätzlichen und völlig neuartigen ADPR-Bindungsstelle im N-Terminus von TRPM2 hin. Inzwischen konnte diese N-terminale ADPR-Bindungstasche in einer Speziesvariante des Zebrafisches (Danio rerio) sowie beim humanen TRPM2 Kanal mittels Kryo-Elektronenmikroskop-Analyse identifiziert werden. Zu Beginn dieser Arbeit war allgemein anerkannt, dass sich die funktionelle Rolle der NUDT9H-Domäne zwischen Vertebraten- und Invertebraten-Varianten von TRPM2 auffallend unterscheidet. Jedoch wurden weder die speziesübergreifende Bedeutung der N-terminalen ADPR-Bindungstasche noch die Frage, welche Faktoren die speziesspezifische Rolle der NUDT9H-Domäne bestimmen, hinreichend verstanden. Darüber hinaus ist die zumindest ebenso faszinierende Fragestellung nach der physiologischen Funktion dieses wichtigen Säugetier-Ionenkanals bei Wirbellosen wie dem Nesseltier-Modellorganismus Nematostella vectensis bis dahin noch nicht untersucht worden. Ziel der vorliegenden Studie war es, wertvolle Beiträge zum Verständnis dieser wichtigen Fragen zu liefern. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die speziesspezifische Rolle von NUDT9H und der N-terminalen ADPR-Bindungstasche durch funktionelle In-vitro-Analyse diverser Kanalmutanten sowie von TRPM2-Chimären untersucht. Darüber hinaus wurden Co-Immunpräzipitationsexperimente (Co-IP) als neuartiger Ansatz verwendet, um eine strukturelle Wechselwirkung zwischen Kanal und NUDT9H-Domäne nachzuweisen. Der zweite Teil dieser Arbeit befasst sich mit der phänotypischen Analyse eines TRPM2-Knockouts in vivo (Nematostella vectensis), insbesondere unter Umweltstressbedingungen, d. h. Exposition gegenüber reaktiven Sauerstoffspezies oder hoher Temperatur. Auf diese Weise sollte getestet werden, ob die physiologische Rolle von TRPM2 bei Nesseltieren ähnlich der bei Säugetieren ist, oder sich im Laufe der Evolution der Vielzeller signifikant verändert hat. Es stellte sich heraus, dass die N-terminale ADPR-Bindestelle in den weit entfernt verwandten TRPM2-Orthologen von Menschen, Zebrafisch und Seeanemone gleichermaßen entscheidend für das ADPR-abhängige Kanal-Gating ist, obwohl davon auch die durch 2-Aminoethoxydiphenylborat induzierte Kanalaktivierung betroffen ist. Darüber hinaus zeigte sich, dass die NUDT9H-Domäne zwischen hsTRPM2 und drTRPM2 ausgetauscht werden kann, ohne dadurch die Kanalfunktion auszuschalten. Weiterhin wurde gefunden, dass innerhalb der NUDT9H-Domäne ein hochkonservierter Asparaginrest existiert, der offenbar generell für die Kanalfunktion von TRPM2-Orthologen von Vertebraten essenziell ist, während er in nvTRPM2 nur die Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress beeinflusst. Die Daten der Co-IP zeigen, dass dieser Asparaginrest zumindest in hsTRPM2 entscheidend an den strukturellen Interaktionen zwischen NUDT9H und der Kanaldomäne von TRPM2 beteiligt ist. Als eines der wichtigsten Resultate zeigt die phänotypische in-vivo-Analyse eines TRPM2-Knockouts von Nematostella vectensis, dass dieser Ionenkanal in Seeanemonen an der zellulären Reaktion sowohl auf oxidativen Stress als auch auf hohe Temperatur beteiligt ist und daher eine ähnliche physiologische Funktion wie beim Menschen ausübt. Als Nebenergebnis wurde eine starke Expression einer Speziesvariante der humanen ADPR-Pyrophoshatase NUDT9 in Nematostella vectensis nachgewiesen. Die Ergebnisse dieser Arbeit können als Grundlage für weitere Untersuchungen dienen, um die funktionelle Entwicklung dieses Ionenkanals besser zu verstehen. Zukünftige Studien an dem etablierten Modellorganismus Nematostella vectensis könnten helfen, das gesamte physiologische Spektrum von TRPM2 zu definieren und die Funktion und Regulation des intrazellulären ADPR-Spiegels besser zu verstehen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Neuroepigenetik [164620]
• [512000-4]