Biochemical and functional analysis of the FBXO7 interactome

• Biochemische und funktionelle Analyse des FBXO7 Interaktoms

Crnkovic, Vanessa Stefanie; Stegmüller, Judith (Thesis advisor); Müller-Newen, Gerhard (Thesis advisor)

Aachen (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2022

Kurzfassung

Das Protein FBXO7 ist eines der Hauptuntereinheiten des SCF-Komplexes. Als E3 Ubiquitinligase-Komplex stellt es eine wichtige Komponente des Ubiquitin-Proteasom-Systems dar und katalysiert die Bindung von Ubiquitin an das Substrat, so dass dieses vom Proteasom abgebaut wird. Mutationen im FBXO7 Protein führen zu Funktionseinschränkungen und somit zu einem sogenannten Pallido-pyramidalen Syndrom im Menschen. Die vorliegende Dissertation, "Biochemische und funktionelle Analyse des FBXO7 Interaktoms", beschäftigt sich zunächst mit der Fragestellung, inwiefern die Untereinheiten BAG6, GET4 und UBL4A des BAG6-Komplexes, welcher als Interaktionspartner von FBXO7 identifiziert wurde, potenzielle Substrate der E3 Ligase FBXO7-SCF darstellen. Darüber hinaus wird der Einsatz der CRISPR/Cas9-Methode als Werkzeug für FBXO7-spezifische Genom-Editierung evaluiert. Mit Hilfe von Western-Blot-Analysen konnte herausgestellt werden, dass in Gegenwart der funktionalen E3 Ligase ausschließlich GET4 ein robustes Schmiersignal aufwies, welches auf Ubiquitinierung hindeutet. Die Durchführung zellbasierter Ubiquitinierungsassays bestätigte, dass das aufgetretene Muster tatsächlich aus Ubiquitin bestand. Auf diesem Wege wurde das Protein GET4 als potentielles neues Substrat von FBXO7 identifiziert und gleichzeitig die anderen beiden Untereinheiten des BAG6-Komplexes ausgeschlossen.Für die Erarbeitung der zweiten Fragestellung wurden zunächst CRISPR/Cas9 Plasmide mit dem humanen FBXO7 als Ziel-Gen generiert. Unter Einsatz von Western-Blot-Analysen wurde bewiesen, dass die neu generierten Plasmide den FBXO7-Proteinspiegel beeinflussen. Die darauffolgenden Proteasom-Aktivitätstest wiesen eine signifikante Reduktion der Protea-somaktivität in den Knockout-Zelllinien im Vergleich zu den Wildtyp-Zelllinien auf. Der Verlust von FBXO7 führt somit zu einer Beeinträchtigung der Proteasomaktivität. Aus diesen Versuchen erschließt sich, dass die CRISPR/Cas9 Methode eine hoch effiziente und zugleich sehr praktikable Technologie darstellt, um innerhalb eines Gens bestimmte Regionen präzise zu modifizieren. Zudem konnte die essentielle Bedeutung des funktionalen FBXO7 für eine reibungslose Funktionalität des Proteasoms nachgewiesen werden.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Chemosensorik [163310]
• [513000-2]