Metabolic engineering of isoprenoids

McElroy, Christopher; Blank, Lars M. (Thesis advisor); Fischer, Rainer (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021, 2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Heutzutage gelten Antibiotika, Chemotherapeutika, Antikörper und Impfstoffe als Grundsteine moderner Medizin. Alltägliche Infektionen, die in früheren Zeiten noch lebensbedrohlich waren, werden in der heutigen Zeit selbstverständlich und einfach mit Antibiotika behandelt. In jüngster Zeit wird nach weiteren neuen Wirkstoffen für die Nutzung in der Humanmedizin gesucht. Für solche Wirkstoffe gibt es keine vielfältigere Quelle als die Natur. Aus wurden viele Medikamente isoliert und auf die Natur sollten wir auch bei der Suche nach neuen Wirkstoffen und Wirkungsmechanismen zurückgreifen. Basierend auf diesen Tatsachen wurde ein faszinierender natürlicher Biosyntheseweguntersucht. Die unaufgeklärten Biosynthesewege von Armillylorsellinat, Melleolide und Armillane verfügen über eine Vielzahl an neuen Strukturen. Mitglieder der Isoprenoid‐Familie besitzen cytotoxische und antimikrobielle Eigenschaften, und einige sind auch phytotoxisch. Eine Nutzung ist allerdings aufgrund der größtenteils unaufgeklärten Biosynthesewege bisher noch nicht möglich. Daher wurde zu Beginn dieser Arbeit die Sequenz des gesamten Genoms sowie das Transkriptom‐Profil von A. gallica FU02472 aufgeklärt, indem bereits vorhandene Transkriptom‐ und Sequenz‐Daten assembliert wurden. Ein Vergleich dieser Genomsequenz mit einem bereits identifizierten Melleolide‐Gencluster, ergab zusätzliche putative Biosynthesegene. Nachdem diese Gene untersucht wurden, wurde eine heterologe cDNA Expressionsbibliothek erstellt, um weitere Gene die Enzyme des Melleolide‐Wegs kodieren zu identifizieren. Trotz der erfolgreichen Etablierung eines Expressions‐Screenings konnten keine neuen Enzyme gefunden werden, die für die Isomerisierung im unbekannten Teil des Melleolid‐Biosynthesewegs verantwortlich sind. Allerdings konnte die nicht‐enzymatische Isomerisierung von Armillylorsellinat‐Vorstufen erfolgreich in einem heterologen Hefesystem gezeigt werden, wodurch ein entsprechendes Enzym in diesem Stamm nicht notwendig ist. Im Folgenden wurde mittels Metabolic Engineering ein Hefestamm als Armillylorsellinat/Melleolide‐Plattform konstruiert, indem ein artifizieller Biosyntheseweg eingebracht wurde. Die Charakterisierung dieses Stammes führte zur Identifizierung vieler neuer Protoilluden‐basierter Produkte, sowie Spuren von Orsellinsäure. Durch weiteres Metabolic Engineering wurde ein Nachfolgerstamm der zweiten Generation generiert. Des Weiteren konnten mehrere neue hydroxylierte Protoilludene gefunden werden, wobei für eins der neuen Produkte (13‐hydroxy‐6‐protoilluden) das verantwortliche Enzym (CYPArm2) identifiziert werden konnte. Schließlich wurde ein neues Medium zur Erhöhung von Produktkonzentrationen und zur vereinfachten Herstellung von Substraten entwickelt.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie [161710]