Nanosonden-basierte Mykotoxin-Detektion in Agrarprodukten

Pietschmann, Jan; Commandeur, Ulrich Heinrich (Thesis advisor); Schillberg, Stefan (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Der natürliche Befall von Futter- und Lebensmitteln mit ubiquitär vorkommenden Pilzen oder Schimmelpilzen verursacht hohe ökonomische Schäden und bedingt durch Schimmelpilzgifte (Mykotoxine), starke gesundheitliche Probleme. Verschiedene Faktoren, wie z. B. eine späte Ernte bzw. eine unsachgemäße Lagerung, begünstigen das Wachstum der Pilze und das Vorkommen der Toxine. Da ein Viertel aller Nahrungsmittel mit mindestens einem Mykotoxin belastet sind, ist eine routinemäßige und zuverlässige Überprüfung der Lebensmittel durch internationale Organisationen gesetzlich vorgeschrieben und unerlässlich. Derzeitige Analysemethoden beruhen vorwiegend auf der Labor-gebundenen Flüssigkeitschromatographie (LC), welche mit Tandem-Massenspektrometern gekoppelt ist (LC MS/MS). Durch dieses extrem kostspielige und empfindliche Equipment ist zwar eine präzise Detektion der Toxine möglich, insbesondere durch die benötige Laborausstattung und das hochausgebildete Fachpersonal eine schnelle vor-Ort Analyse der Lebensmittel durch den Laien jedoch nicht möglich. Dahingehend wurden weitere Methoden entwickelt, die auf immunologischen Prinzipien beruhen, wie z. B. der ELISA oder Lateral Flow Assays (LFA). Zwar konnten so anwenderfreundlichere Testsysteme entwickelt werden, die aber, bedingt durch die weiterhin nötige Laborausstattung (ELISA) oder der fehlenden präzisen Quantifizierungs-möglichkeit (LFA), nur für eine Schnellkontrolle geeignet sind. Durch die geringe Zuverlässigkeit können lebensmittelverarbeitende Betriebe und Landwirte auf kostenintensive Analysen in zertifizierten Analyselaboren nicht verzichten. Um zukünftig eine hochsensitive, quantitative vor-Ort Detektion der für die Industrie besonders relevanten Toxine Aflatoxin B1, Zearalenon, Ochratoxin A und Deoxynivalenol in Weizen zu ermöglichen, wurde in dieser Arbeit ein neuartiger, kompetitiver magnetischer Immunodetektions (cMID)-Assay zur Analyse der Toxine konzipiert und etabliert. Durch die Generierung Aflatoxin B1- sowie Ochratoxin A-spezifischer monoklonaler Antikörper (mAb) mittels Hybridomatechnologie und dem Einsatz von kommerziellen mAb gegen Zearalenon und Deoxynivalenol konnten zunächst optimierte Referenzassays auf Basis eines kompetitiven ELISAs (cELISA) etabliert werden, womit Anhaltspunkte für mögliche Sensitivitäten gewonnen wurden. Für die anschließende Entwicklung des neuartigen cMID-Assays wurden geeignete Parameter, wie die Beschichtungskonzentration, die jeweiligen Antikörpermengen sowie Nanosonden-Art bzw. Menge identifiziert. Dadurch konnte innerhalb der mit Mykotoxin-Konjugat beschichteten Immunofiltrationssäulen (Immunoltration column, IFC) eine kompetitive Bindungsreaktion der funktionalisierten mAb erreicht werden, wobei die mAb in Abhängigkeit von der Menge des zuvor in der Probe gebundenen Mykotoxins innerhalb der IFC angereichert werden können. Mittels der anschließenden Markierung der mAb mit funktionalisierten Nanosonden, welche im Gravitationsfluss durch die IFC gespült werden, kann ein magnetisches Messsignal in Abhängigkeit der zurückgehaltenen mAb mittels eines portablen Magnetreaders detektiert werden. Dies lässt eine hochsensitive, quantitative Detektion der Toxinkonzentration in der Probe zu. Durch die Entwicklung eines Extraktionspuffers mittels LC MS/MS und statistischer Versuchsplanung (Design of Experiment, DoE), konnten alle vier Toxine simultan mit hoher Präzision und Zuverlässigkeit aus Weizen extrahiert und mittels cMID mit über 90 % Genauigkeit quantitativ detektiert werden, was durch Spiking-Experimente bestätigt wurde. Durch die Entwicklung eines Separationsdemonstrators konnte als Proof of Concept eine mögliche Steigerung der Sensitivität durch magnetische Anreicherung der Nanosonden gezeigt werden, wobei dies in einer Separationseffizienz von über 95 % resultierte. Um abschließend das weitere Potential der cMID aufzuzeigen, wurde, zur Steigerung der Nutzerfreundlichkeit, die Lagerfähigkeit der beschichteten IFCs sowie die Möglichkeit der Verkürzung der Assayzeiten demonstriert.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Molekulare Biotechnologie [162910]