Metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii for the production of butanol and hexanol

Lauer, Ira; Blank, Lars M. (Thesis advisor); Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Acetogene Mikroorganismen besitzen die bemerkenswerte Eigenschaft C1-Gase (CO und CO2) zu Biomasse und verschiedenen Produkten, hauptsächlich Acetat, zu verstoffwechseln. Da vor allem CO2 eine große Rolle als Treibhausgas spielt und seine Konzentration in der Atmosphäre stetig steigt, könnten Acetogene zur Reduktion der CO2-Emissionen aus Prozessgasen herangezogen werden. Obwohl bereits wenige Pilotanlagen Ethanol aus Stahlwerks-Abgasen mit Clostridium-Spezies herstellen, bedarf es noch einiger Weiterentwicklung der Mikroorganismen, vor allem im Bereich des metabolic engineering, um ein breites Produktspektrum zu ermöglichen. Mit diesem Ziel wird in dieser Arbeit die Nutzung von Synthesegas (CO, CO2 und H2) mit dem anaeroben, acetogenen Bakterium Clostridium ljungdahlii zur Herstellung der Plattformchemikalien Butanol und Hexanol untersucht. In dieser Arbeit wurde ein Konstrukt zur Bildung von Butanol und Hexanol in das Genom von C. ljungdahlii zur stabilen Expression integriert und dadurch die Produkttiter, im Vergleich zu einem Stamm, welcher die entsprechenden Gene plasmidbasiert exprimierte, gesteigert. In einer kontinuierlich begasten Fermentation konnten 451 mg L-1 Butanol und 122 mg L-1 Hexanol produziert werden. Potentielle Limitationen der Proteinexpression im Biosyntheseweg wurden im Vergleich zu dem plasmidbasierten Stamm mit Hilfe von LC-MS/MS-basiertem targeted proteomics identifiziert. Nachdem im Folgenden ein Promoter-Austausch nur zu einer leichten Steigerung der C4-Produkte (Butanol und Butyrate) normiert auf die Biomasse führte, wurde ein zusätzliches Biosynthese-Operon aus dem natürlichen Produzenten Clostridium carboxidivorans eingebracht und ebenfalls in das Genom integriert, sodass nun eine zweifache genomische Integration vorlag. Dies bewirkte eine 17-fache Steigerung der Hexanol-Bildung verglichen zum plasmidbasierten Ausgangsstamm in kleinem Maßstab und lieferte deutliche Hinweise, dass die von einer Thiolase katalysierte Kettenverlängerung von Butyryl-CoA mit Acetyl-CoA zum C6-Molekül der limitierende Schritt im Hexanol-Biosyntheseweg in den vorherigen Produktionsstämmen war. Das Verhältnis der produzierten Alkohole hat sich in diesem Stamm deutlich zum längerkettigen Hexanol verschoben mit 393 mg L-1 Hexanol und 109 mg L-1 Butanol in einer kontinuierlich begasten Fermentation. Des Weiteren wurde eine Gaszusammensetzung von 20% CO2, 80% H2 als günstig für die Butanol- und Hexanol-Bildung identifiziert. Der Einfluss verschiedener Medienzusätze wurde untersucht, jedoch konnte mit den getesteten Parametern keine Steigerung der Produktkonzentrationen erreicht werden. Im Gegensatz dazu konnte durch eine Änderung der Prozessparameter wie der Reduzierung der Kultivierungstemperatur von 37 °C auf 30 °C eine Erhöhung der Hexanol-Konzentration erzielt werden. Schließlich konnte gezeigt werden, dass ausgewählte Verunreinigungen, die im industriellen Abgas vorkommen, keinen negativen Einfluss auf Wachstum und Produktbildung im untersuchten Produktionsstamm hatten.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie [161710]