Unraveling the interplay of MLO and exocyst complex proteins in localized secretion in plant cells

• Untersuchung des Zusammenspiels von MLO und EXO70 Proteinen in der lokalisierten Sekretion in Pflanzenzellen

Hübbers, Jan Wilhelm; Panstruga, Ralph (Thesis advisor); Buyel, Johannes Felix (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022, 2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

"Mildew resistance Locus O" (MLO) Gene kodieren pflanzenspezifische integrale Membranproteine, die in sieben Klassen unterteilt werden. MLO Proteine der Klassen IV und V haben wirtschaftliche Relevanz erlangt, da Funktionsverlust-Mutationen in ihren kodierenden Genen eine stabile Resistenz gegen die pilzliche Mehltauerkrankung vermitteln. Obwohl MLO Proteine kürzlich als vermeintliche Calciumkanäle identifiziert wurden, bleib es rätselhaft, wie sich diese Calciumkanalaktivität in die mlo-vermittelte Mehltauresistenz und andere MLO-assoziierte zelluläre Prozesse einfügt. In der Modelpflanze Arabidopsis thaliana führt der Funktionsverlust von bestimmten MLO Proteinen zu Defekten in Prozessen, die mit lokalisierter Sekretion assoziiert sind. Diese Prozesse umfassen die Wurzel-Thigmomorphogenese, die Leitung von Pollenschläuchen zur Eizelle und das Wachstum des Pollenschlauchapex. Lokalisierte Sekretion beschreibt die Umleitung von sekretorischen Prozessen an bestimmten Regionen des zellulären Kortex für die gezielte Sekretion von Zellbestandteilen. Die Annahme das MLO Proteine eine entscheidende Rolle in der lokalisierten Sekretion spielen wird untermauert durch nahezu identische Defekte in der Zellwanddeposition in Trichomen auf mehltauresistenten mlo2 mlo6 mo12 Mutanten und Trichomen, die der Exocyst-Komplexuntereinheit EXO70H4 beraubt wurden. Die EXO70 Untereinheiten des konservierten oktameren Exocyst-Komplex werden als wichtige Stellglieder für die bisher weitgehend unbekannten mechanischen Grundlagen der lokalisierten Sekretion in Pflanzenzellen angesehen. Auf Basis der phänotypischen Überlappung von exo70H4 und mlo2 mlo6 mo12 Mutanten in Trichomen habe ich die Frage adressiert, ob lokalisierte Sekretion durch ein Zusammenspiel von MLO Proteinen und EXO70 Proteinen im sekretorischen Weg vermittelt wird. Zunächst entwickelte ich eine Methode für die effiziente Isolation von A. thaliana Trichomen, um eine tiefgreifende Analyse der Zellwände von Wildtyp- und Mutanten-Trichomen zu ermöglichen. Ich habe gezeigt, dass so isolierte Trichome für verschiedene nachgelagerte Analysen geeignet sind, einschließlich einer Charakterisierung des Trichom-Proteoms. Anschließend habe ich isolierte Wildtyp- sowie exo70H4 und mlo2 mlo6 mo12 Mutanten-Trichome für verschieden Zellwandanalysen verwendet. Während histochemische Färbungen dieser Trichome bestätigten, dass exo70H4 und mlo2 mlo6 mo12 Mutanten nahezu identische Defekte in der gerichteten Exozytose von Zellwandkomponenten aufweisen, deuteten eine quantitative Analyse von Zellwandmonosacchariden und Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie auf globale Zellwandveränderungen in diesen Mutanten-Trichomen hin. Luciferase Komplementierung zeigte, dass MLO2, MLO6 und MLO12 präferiert mit bestimmten EXO70 Untereinheiten interagieren. Mithilfe des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems habe ich die Interaktion des MLO6-EXO70H4-Tandems bestätigt und gezeigt, dass die Interaktion zwischen MLO6 und EXO70H4 durch den Carboxy-Terminus des MLO6 Proteins vermittelt wird. In diesem Zusammenhang habe ich eine umfassende in silico Analyse von 341 publizierten MLO Sequenzen verschiedener Spezies durchgeführt und ein konserviertes Motiv im Carboxy-Terminus von MLO Proteinen der Klassen IV und V identifiziert, dass die Bindung von Zielproteinen vermitteln könnte. Abschließende Infektionsexperimente mit dem adaptierten Mehltaupilz Erysiphe cruciferarum haben gezeigt, dass eine Kombination von mlo und exo70H4 Mutationen einen synergistischen Effekt auf die Mehltauresistenz von A. thaliana hat. Meine Daten belegen eine gemeinsame Funktion von MLO Proteinen und EXO70H4 im sekretorischen Weg und werfen die Frage auf, ob EXO70-MLO Membranmodule ein konservierter Mechanismus zur Vermittlung der lokalisierten Sekretion in Pflanzenzellen sind.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Molekulare Zellbiologie der Pflanzen [161920]