Patient specific JAK2 V617F iPS cells for modelling bone marrow fibrosis

Böhnke, Janik; Zenke, Martin (Thesis advisor); Wagner, Wolfgang (Thesis advisor); Pradel, Gabriele (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022, 2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Bei der Myelofibrose wird blutproduzierendes Knochenmark durch die Einlagerung von extrazellulären Matrixproteinen (ECM) durch fibrotisches Gewebe ersetzt. Der Auslöser ist die maligne Proliferation hämatopoetischer Stammzellen (HSC), welche durch veränderte Zytokinexpression die Aktivierung, Proliferation und Differenzierung von mesenchymalen und stromalen Stammzellen (MSC) in Myofibroblasten bewirken. Die Myelofibrose entsteht als primäre Myelofibrose (PMF) oder als Sekundärerkrankung aus myeloproliferativen Neoplasien (MPN) wie der Polycythaemia Vera (PV). In mehr als 95% der PV Patienten ist die JAK2 V617F Mutation der Auslöser. Die Gain-of-Function Mutation führt zu einer Phosphorylierung der Tyrosinkinase JAK2 ohne die Bindung eines Liganden (wie Thrombopoietin (TPO) oder Erythropoietin (EPO)). Hierdurch wird die Blutproliferation dauerhaft stimuliert, was insbesondere Megakaryozyten und Thrombozyten betrifft. In dieser Arbeit wurden reprogrammierte JAK2 V617F mutierte induzierte pluripotente Stammzellen (iPS Zellen) von drei PV Patienten verwendet. Die JAK2 V617Fhom Mutation wurde in den iPS Zellen eines Patienten mit CRISPR/Cas9 repariert. Zudem wurde CRISPR/Cas9 für den funktionalen Knockout des Chemokins CXC motif ligand 4 (CXCL4, auch platelet factor 4, PF4) genutzt, welches als möglicher Effektor bei der Ausbildung von Myelofibrose gilt. Weiterhin haben wir in unserem Labor ein Differenzierungsprotokoll zur Generierung von HSC und Megakaryozyten aus iPS Zellen etabliert und verbessert. Die JAK2 V617F differenzierten HSC und Megakaryozyten zeigten im Vergleich zu unmutierten Zellen eine beschleunigte Differenzierungskinetik, eine schnellere Maturierung, die vermehrte Bildung von Erythrozyten aus HSC und die TPO unabhängige Differenzierung von HSC in Megakaryozyten. RNA Sequenzierung zeigte deutliche Unterschiede in der Genexpression von JAK2 V617F Megakaryozyten im Vergleich zu JAK2 unmutierten Klonen, wie beispielsweise eine geringere Expression von Genen der ECM. Die JAK2 V617F Megakaryozyten wurden zusammen mit BM-MSC (bone marrow-MSC, Knochenmark-MSC) für ein 2D Kokulturmodell genutzt, um die Interaktionen von Megakaryozyten und MSC genauer zu untersuchen. Hierbei wurde keine vermehrte Myelofibrose in der Kokultur mit JAK2 V617Fhom Megakaryozyten im Vergleich zu unmutierten Zellen festgestellt werden. Insgesamt wurde in dieser Arbeit eine große Bandbreite an klonalen iPS Zellen aus drei verschiedenen PV Patienten generiert, die Differenzierung dieser Zellen zu HSC und Megakaryozyten etabliert und mit Expressionsanalysen sowie ersten Kokulturversuchen die Basis für weitere funktionale Studien zur Erforschung von Myelofibrose geschaffen.

Einrichtungen

• Lehr- und Forschungsgebiet Zelluläre und Angewandte Infektionsbiologie [164020]
• Fachgruppe Biologie [160000]
• [811002-2]