Inflammatory regulation of the metalloproteinase ADAM17 by the pseudoprotease iRhom2 in epithelial cells

Giese, Anja Adelina; Ludwig, Andreas (Thesis advisor); van Dongen, Joost Thomas (Thesis advisor); Fabry, Martha Elisabeth (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2022, 2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Kurzfassung

Initiierung und Verlauf von chronischen Darmerkrankungen werden maßgeblich von der Metalloproteinase ADAM17 beeinflusst. Durch das Shedding von membrangebundenen Substraten kann diese Protease entzündliche, sowie regeneratorische Prozesse regulieren. Außerdem beeinflusst sie die parazelluläre Permeabilität der epithelialen Darmbarriere. Die Aktivierung und Lokalisation von ADAM17 an der Plasmamembran wird durch die Pseudoproteasen iRhom1 und iRhom2 reguliert. Diese Adapterproteine binden an die Proform von ADAM17 im endoplasmatischen Retikulum, unterstützen den Transport während des Reifungsprozesses durch den Golgi-Apparat und schließlich den Einbau der aktiven Form von ADAM17 in die Plasmamembran. Laut Literatur wird iRhom1 ubiquitär und iRhom2 hauptsächlich in Immunzellen exprimiert. Im Rahmen dieser Dissertation konnte über eine Transkriptomanalyse gezeigt werden, dass iRhom2 mRNA auch in gesundem menschlichen Dickdarmgewebe nachweisbar ist. Die Analyse ergab zudem, dass eine induzierte Expression von iRhom2 in Epithelzellen aus akut entzündetem Gewebe von Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen vorliegt. Diese Regulation der Expression konnte in vivo im Mausmodell, sowie in vitro in verschiedenen Zelllinien reproduziert werden. Somit scheint es sich hierbei um einen generellen und keinen zellspezifischen Mechanismus handeln. Zudem konnte gezeigt werden, dass iRhom2 in der humanen epithelialen Kolonkarzinom Zelllinie HT-29 basal exprimiert und synergistisch von IFNγ und TNFα induziert wird. Hierbei zeigte sich, dass es sich bei der Induktion der iRhom2 Transkription um einen zeitlich streng limitierten Prozess handelt, dessen Maximum bei 6 Std liegt. Über die Definition eines potenziellen Promoterbereichs gelang es zudem 3 Signaltransduktionswege zu identifizieren, die an der Induktion von iRhom2 beteiligt sind. Durch eine pharmakologische Inhibition von Schlüsselproteinen der jeweiligen Signalwege (JAK1/2, NF-κB oder AP-1) konnte der Einfluss der einzelnen Signaltransduktionswege bestätigt werden. Des Weiteren konnte mit Hilfe eines Luziferase Assays gezeigt werden, dass nach Co-Stimulation mit IFNγ und TNFα die Transkription ausgehend von der definierten Promoterregion initiiert wird. Mittels eines ADAM17 Aktivitätsassays konnte die direkte Abhängigkeit der Metalloprotease von iRhom2 gezeigt werden. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Inhibition von iRhom2 durch die Blockade eines Signaltransduktionsweges über JAK1/2, NF-κB oder AP-1 zu einem reduzierten Shedding von TGFα führt. Somit steht fest, dass die inflammatorische Aktivität von ADAM17 direkt von der Expression von iRhom2 abhängt. Zur Verifizierung dieses Ergebnisses wurde untersucht, ob durch eine Überexpression der iRhoms eine inflammatorische ADAM17-Aktivität hervorgerufen werden kann. Es zeigte sich, dass dies bei einer kurzzeitigen Überexpression von iRhom2 nicht möglich ist. Das überexprimierte iRhom2 Protein verfügte lediglich über eine geringe Stabilität, da keine gleichzeitige Steigerung von ADAM17, als Stabilisierungsfaktor, stattfand. Bei einer stabilen Überexpression von iRhom2 hingegen kam es über die Zeit zu einer Akkumulation von aktivem ADAM17 auf der Zelloberfläche. Es konnte basal erhöhtes Shedding von TGFα und JAM-A nachgewiesen werden, welches durch Co-Stimulation mit IFNγ und TNFα noch weiter gesteigert werden konnte. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass die Induktion von iRhom2 tendenziell zu einer Reduktion von iRhom1 führt, was auf einen kompensatorischen Mechanismus hindeutet. Im letzten Abschnitt wurde der Einfluss fehlender iRhoms untersucht. Hier konnte gezeigt werden, dass ein Knockdown von iRhom1, iRhom2 oder beiden iRhoms drastische Folgen für die untersuchten Epithelzelllinien hatte. Der Knockdown führte in HT-29 Zellen und der humanen epithelialen Lungenkarzinomzellline A549 zu einem starken Verlust der Vitalität und einem Absterben der Zellen. Dieses Ergebnis unterstreicht die Befunde anderer Gruppen, dass es sich bei iRhom1 und iRhom2 um lebensnotwendige Proteine für epitheliale Tumorzellen handelt. Diese Befunde weisen darauf hin, dass die gezielte Blockade von iRhom2 bei entzündlichen und/oder malignen Darmerkrankungen ein Ansatz für künftige Behandlungen sein kann.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Molekulare Ökologie der Rhizosphäre [163720]
• [528500-2]