A lncRNA identifies an IRF8 enhancer element in negative feedback control of dendritic cell differentiation

Xu, Huaming; Zenke, Martin (Thesis advisor); Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2023)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2023

Kurzfassung

Alle Blutzellen entwickeln sich aus hämatopoetischen Stammzellen (hematopoietic stem cells, HSC), einschließlich der Antigen-präsentierenden dendritischen Zellen (dendritic cells, DC). DC sind hochspezialisierte Immunzellen mit einer Schlüsselfunktion für Immunität und Toleranz, und verbinden angeborene und adaptive Immunität. DC entwickeln sich aus HSC über aufeinanderfolgende Schritte von Determinierung und Differenzierung. Genauer gesagt, entwickeln sich HSC im Knochenmark (bone marrow, BM) zunächst zu multipotenten Vorläuferzellen (multipotent progenitors, MPP), die weiter zu DC-determinierten Vorläuferzellen (common DC progenitors, CDP) differenzieren und dann weiter zu klassischen DC des Typs 1 und 2 (classical DC type 1 and 2, cDC1 bzw. cDC2) und zu plasmazytoiden DC (pDC). Interferon regulatory factor 8 (IRF8) ist ein hämatopoetischer Transkriptionsfaktor (TF) mit einer zentralen Bedeutung im regulatorischen DC Gennetzwerks und der demzufolge in der DC Differenzierung einer komplexen epigenetischen Regulation unterliegt. Die IRF8 Expression beginnt in der CDP Phase und ist in pDC und cDC1 besonders hoch. Wie die IRF8 Expression reguliert und schließlich begrenzt wird, und welche epigenetischen Mechanismen dabei eine Rolle spielen, ist jedoch weitgehend unbekannt. In der vorliegenden Studie verwendeten wir einen integrierten Ansatz mit ATAC-seq, ChIP-seq, Chromatin Conformation Capture (3C) und RNA-seq, um die Genexpression und die epigenetische Dynamik von IRF8 während der DC Differenzierung zu verfolgen. Es zeigte sich, dass der IRF8-Promotor bereits im CDP-Stadium mit seinen flankierenden Enhancern interagiert, wobei in pDC und cDC1 besonders häufige Interaktionen mit seinen vor- und nachgeschalteten Sequenzen gefunden wurden. In diesem Zusammenhang haben wir eine neue lange nicht-kodierende RNA (long non-coding RNA, lncRNA) identifiziert, die von dem +32 kb-Enhancer stromabwärts von der IRF8 Transkriptionsstartstelle (TSS) transkribiert und spezifisch in pDC exprimiert wird, und die wir nachfolgend als lncIRF8 bezeichnen. Der +32 kb Enhancer-Locus zeigt unterschiedliche epigenetische Signaturen in pDC im Vergleich zu cDC1, was auf eine mögliche Rolle von lncIRF8 bei der Spezifikation der DC Untergruppen hinweist. Die begrenzte Lebensdauer von BM Zellen in vitro macht die Genom-Editierung oder die Erzeugung stabiler transgener Zellen schwierig. Daher haben wir ein experimentelles System von konditional immortalisierten HoxB8 MPP entwickelt. HoxB8 MPP werden mit einem Vier-Zytokin-Cocktail aus Stammzellfaktor (stem cell factor, SCF), Flt3-Ligand (Flt3L), Insulin-ähnlichem Wachstumsfaktor-1 (insulin-like growth factor 1, IGF-1) und IL-6/löslichem IL-6-Rezeptor-Fusionsprotein (hyper-IL-6) kultiviert und können die DC Differenzierung originalgetreu abbilden. Darüberhinaus können HoxB8 MPP durch die Methoden der Genom-Editierung durch CRISPR/Cas9 gezielt verändert werden. Wir haben gefunden, dass der lncIRF8-Promotor, nicht aber lncIRF8 selbst, für die pDC und cDC1 Entwicklung entscheidend ist, wie durch Knockout (KO) des lncIRF8-Promotors mittels CRISPR/Cas9, lncIRF8 Überexpression und lncIRF8 Reexpression gezeigt. Wir ziehen daraus die Schlußfolgerung, dass lncIRF8 als Indikator für die Aktivität des IRF8 +32 kb Enhancers fugiert. Die CRISPR Aktivierung und CRISPR Interferenz von lncIRF8- und IRF8-Promotoren durch dCas9-VP64 bzw. dCas9-KARB zeigten, dass (i) die IRF8-Expression durch den +32 kb-Enhancer aktiviert wird und dass (ii) dasselbe Enhancer-Element eine negative Rückkopplungsschleife während der DC Differenzierung erzeugt, die die IRF8-Expression begrenzt. Die CRISPR Aktivierung des lncIRF8-Promotors fördert die cDC1-Entwicklung dramatisch, während die CRISPR Interferenz der lncIRF8- und IRF8-Promotoren die pDC und auch die cDC1-Entwicklung beeinträchtigt. Zusammenfassend schlagen wir hier ein Modell vor, bei dem die IRF8 Expression während der DC Entwicklung zunächst durch seine flankierenden Enhancer, einschließlich des +32 kb-Enhancers, aktiviert und dann durch Rückkopplungshemmung über das lncIRF8 Promotorelement im +32 kb-Enhancer begrenzt wird. Unsere Arbeit zeigt eine bisher unerkannte negative Rückkopplungsschleife von IRF8, die die IRF8 Expression orchestriert und damit die DC Differenzierung steuert.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Neuroepigenetik [164620]
• [531040-2]