The role of phosphoinositides in the primary cilium length and stability

• Die Rolle von Phosphoinositiden für die Länge und Stabilität in primären Zilien

Stilling, Simon; Falkenburger, Björn Henrik (Thesis advisor); Spehr, Marc (Thesis advisor); Marquardt, Till (Thesis advisor)

Aachen (2019)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Primäre Zilien sind sensorische Organellen auf der Oberfläche von vielen post- mitotischen Zellen. Einige Aspekte der ziliären Funktion sind nicht vollständig verstanden: Die Zilien-Membran ist eine Verlängerung der Plasma-Membran, unterscheidet sich jedoch in der Ausstattung und Verteilung von Phospholipiden. Konkret zeigt das Signal-Lipid Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) im proximalen Teil des Ziliums eine vergleichbare Dichte wie in der Plasma-Membran. Im distalen Teil des Ziliums ist diese Verteilung verändert und PIP2 kommt nur in reduzierter Dichte vor. Um die funktionelle Relevanz dieser unterschiedlichen Lipid- Verteilung zu bestimmen, wurde mittels chemisch induzierter Protein-Dimerisation selektiv PIP2 in der Zilium-Membran synthetisiert oder depletiert. Mit der Hilfe von Live Cell Imaging konnte ich nach der Synthese von PIP2 ein „Abbrechen“ der Zilien beobachten. Diese ziliäre Teilung erforderte die Polymerisation von Aktin innerhalb des Ziliums. Außerdem waren die ziliären Teilungen abhängig von den kleinen GTPasen Rho/Rac, von der Aurora Kinase A (AurkA) und von Histon-Deacetylase 6 (HDAC6). Das Erscheinungsbild und der Signalweg der beobachteten Zilien-Teilung war ähnlich wie bei der ziliären „decapitation“, welche durch Serum induziert wird und für den Wiedereintritt in den Zell-Zyklus essentiell ist. Außerdem gab es Ähnlichkeiten zwischen der Zilien-Teilung und Vesikel-Abschnürungen, die nach Rezeptor- Stimulation bei zeitgleicher Hemmung von retrogradem Transport oder Endozytose beobachtet wurden. Ich konnte zeigen, dass eine Rezeptor-Stimulation zu einer Akkumulation von PIP2 innerhalb des Ziliums führt und Vesikel-Abschnürung ziliäres PIP2 benötigt. Folglich scheint ein ähnlicher Signalweg drei unterschiedliche Vorgänge zu vermitteln, Vesikel-Abschnürungen, ziliäre „Decapitation und Zilien-Teilung.Um diese Entdeckungen auf humane Erkrankungen anzuwenden, wurde Inpp5e, eine PIP2 5-phosphatase, die in der Ziliopathie Joubert Syndrom mutiert ist, mittels siRNA herunterreguliert. Der daraus resultierende Phänotyp der Zilien konnte durch Depletion von PIP2 verbessert werden, aber auch durch Inhibition von Aktin- Polymerisation, Rac, AurkA oder HDAC6. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass ein Signalweg aus PIP2 Anstieg, Aktin-Polymerisation, Rac, AurkA und HDAC, verantwortlich für diverse zelluläre Events ist. Ich nehme an, dass dieser Signalweg im Falle der durch Inpp5e-Mutationen induzierten Ziliopathien überaktiv ist. Ziliopathien könnten demnach durch Hemmung von AurkA oder HDAC6 therapeutisch beeinflusst werden.Wenn ziliäres PIP2 künstlich depletiert wurde, wurde ein Wachstum der Zilien beobachtet. Das Wachstum erforderte eine Exozytose von Vesikeln aus dem Golgi- Apparat. Da Endozytose PIP2 benötigt, passen diese Ergebnisse zur Hypothese, dass die Verfügbarkeit von PIP2 im proximalen Bereich des Ziliums den Umsatz ziliärer Membranen über Exozytose und Endozytose ermöglicht.Zusammenfassend spielt PIP2 eine Schlüsselrolle für die Stabilität, Längenregulation und Membran-Umsatz primärer Zilien.