Structure and function of the plasma protein fetuin-B

Schmitz, Carlo; Jahnen-Dechent, Wilhelm (Thesis advisor); Fabry, Marlies (Thesis advisor); Spehr, Marc (Thesis advisor)

Aachen (2019)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Fetuin-B ist ein hepatisches Plasmaprotein und essenziell für die Befruchtung der Säuger-Eizelle. In vitro Studien bestätigten Fetuin-B als potenten Inhibitor der Metalloproteinase Ovastacin. In weiblichen Fetuin-B defizienten (Fetub-/-) Mäusen wird Ovastacin vor der Befruchtung nicht inhibiert, was zu einer vorzeitigen Umstrukturierung der Zona Pellucida und somit zur weiblichen Infertilität führt. Innerhalb dieser Studie konnte die Fertilität von weiblichen Fetub-/- Mäusen durch das Einbringen einer zusätzlichen Ovastacin Defizienz wieder hergestellt werden. In Abwesenheit der Zielproteinase Ovastacin blieb das Fehlen seines spezifischen Inhibitors Fetuin-B ohne weitere Auswirkung. Somit konnte das Proteinase-Inhibitor Paar ebenfalls in vivo bestätigt werden. Das Hauptziel dieser Arbeit war es, die Struktur-Funktions-Beziehung zwischen Fetuin-B und Ovastacin genauer zu untersuchen. Dazu wurden im wesentlichen zwei Ansätze verfolgt: Zum Einen sollte anhand von Fetuin Chimären und Einzeldomänen Proteinen der inhibitorisch aktive Bereich von Fetuin-B näher eingegrenzt werden. In einem zweiten Ansatz sollte geeignetes Material für Ko-Kristallisationsexperimente von Fetuin-B und Ovastacin produziert werden. Letztendlich wurden im Labor unseres Kooperationspartners Kristalle von murinem Fetuin-B aus Insektenzellen im Komplex mit Flusskrebs Astacin, einem Ovastacin-Homolog, erhalten. Die Struktur konnte mit einer Auflösung von 3.1 Å gelöst werden. Fetuin-B besteht aus drei Domänen, zwei N-terminalen Cystatin-ähnlichen Domänen (CY1, CY2), gefolgt von einer Prolin-reichen C-terminalen Region (CTR). CY1 und CY2 nehmen die typische Cystatin-Faltung, bestehend aus einem fünf-strängigen, antiparallelen β -Faltblatt, das um eine zentrale α-Helix gewickelt ist, an. Die folgende CTR besitzt nur wenige Sekundärstrukturelemente und ist daher sehr flexibel und zum Teil intrinsisch ungeordnet. CY1 und CY2 sind über ein Linker-Segment verbunden, das ein für die Astacin-Inhibition essenzielles CPDCP Motiv aufweist. Dieses Motiv bildet gemeinsam mit der Haarnadelschleife I von CY2 einen zweiteiligen Keil, der in den aktiven Spalt von Astacin hineinragt und dieses blockiert. CY1 und die Haarnadelschleife II von CY2 haben lediglich eine Gerüstfunktion, während die CTR überhaupt nicht an der Inhibition beteiligt ist. Dieser Inhibitionsmechanismus wurde in Anlehnung an die Papain-Inhibition durch Einzeldomänen-Cystatine ’raised elephant-trunk model’ bezeichnet. Der strukturbasierte Inhibitionsmechanismus konnte anhand der innerhalb dieser Dissertation angefertigten Fetuin Chimäre und Punktmutanten bestätigt werden. Enzymkinetiken von ausgewählten Mutanten bestätigten zudem, dass der für Astacin beschriebene Inhibitionsmechanismus ebenfalls in Säugern für Ovastacin gültig ist. Die beiden essenziellen inhibitorischen Motive, das CPDCP Motiv sowie die Haarnadelschleife I in CY2, sind auch in anderen Wirbeltierklassen wie Reptilien und Vögeln hochkonserviert. Da Astacin-ähnliche Proteinasen im Tierreich ebenfalls weit verbreitet sind, ist es wahrscheinlich, dass das vorgeschlagene ’raised elephant-trunk model’ Wirbeltierklassen-übergreifend wirksam ist.