Investigating the metabolism of Pichia pastoris for improved recombinant protein production

• Die Erforschung des Metabolismus von Pichia pastoris zur Verbesserung der rekombinanten Proteinproduktion

Förster, Jan; Blank, Lars M. (Thesis advisor); Oldiges, Marco (Thesis advisor)

1. Auflage. - Aachen : Apprimus Verlag (2019)
Buch, Doktorarbeit

In: Applied microbiology 15
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (XIII, 172 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Aufgrund der stetig steigenden Nachfrage nach Proteinen rücken die zur Produktion verwendeten Organismen und ihr Metabolismus in den Fokus. Anwendungen, die von Waschdetergenzien bis hin zu Bio-Pharmazeutika reichen, fordern einerseits niedrige Produktionspreise sowie andererseits hohe Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der post-translationalen Modifikationen. Neben Bakterien und Säugetierzellen sind Hefen sehr gut etablierte Produktionsorganismen. Zu diesen Hefen gehört Pichia pastoris, die immer stärker in der Industrie für rekombinante Proteinproduktion genutzt wird. In dieser Arbeit stehen die Vergrößerung des Wissensraums von P. pastoris sowie die Werkzeuge für die Protein-Produktionspipeline im Fokus. Für die Optimierung von Pichia pastoris wird detailliertes Wissen über das Aminosäure-Netzwerk benötigt. Die Aminosäure Leucin wurde als Paradebeispiel ausgewählt, da ihre Biosynthese aus einem kompartimentierten Multi-Enzym-Stoffwechselweg besteht, der in Saccharomyces cerevisiae (Backhefe) von duplizierten Genen codiert wird. Nichtsdestotrotz gab es bisher keine Informationen über den Stoffwechselweg in anderen Hemiascomyceten. Eine Kombination von bioinformatischen Analysen und Proteinlokalisationsstudien zeigte jedoch, dass Backhefe nicht als generelle Vorlage für jeden Aminosäure-Biosyntheseweg in Hefen verwendet werden kann. Letzt endlich konnte die Struktur des Leucin Biosynthesewegs in P. pastoris bestimmt werden. Mit den zuvor gewonnenen Informationen konnte die Theorie, die Aminosäure-Verfügbarkeit mithilfe der Deregulation des Biosynthese-Stoffwechselwegs zu erhöhen, am Beispiel von Leucin aufgezeigt werden. In vielen Aminosäure-Stoffwechselwegen kommt Feedback-Inhibierung vor. Diese wurde hier durch Mutagenese des alpha-Isopropylmalat-Synthase-Gens (LEU4) mithilfe des nicht verstoffwechselbaren Leucin-Analogons Trifluoroleucin entfernt. Experimente mit 13C-markierter Glukose ermöglichte die Messung der von der Zelle selbst synthetisierten Aminosäuren. In der Tat führte die Mutagenese zu einer erhöhten Leucin-Produktion. Diese Vorgehensweise ermöglicht es, Stämme herzustellen, die maßgeschneidert sind für die Überproduktion bestimmter Aminosäuren. Diese Stämme können dann für die Produktion von rekombinanten Proteinen genutzt werden, die besonders viele dieser Aminosäuren für ihre Produktion benötigen. Bei P. pastoris besteht die Herausforderung darin, nach der Transformation die Stämme zu identifizieren, die besonders viel Protein produzieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Hefe so modifiziert, dass sie magnetisch wurde. Der Knock-out des Vakuolen-Transporterproteins Ccc1p führt zur Ansammlung von Eisen, sofern Eisencitrat präsent ist. Zwar war es möglich, einzelne Hefen zu bewegen, allerdings war die magnetische Anziehung so schwach, dass keine kürzere Trennzeit als 6 h erreicht werden konnte. Ein verbessertes Design wird diskutiert. Für viele Anwendungen ist die Glykosylierung besonders wichtig. Allerdings ist der Einfluss des Metabolismus auf die Glykosylierung selten quantifiziert. Besondere Aufmerksamkeit wurde hier der Glykosylierungkettenlänge in Bezug auf die Anzahl der Glykosylierungstellen gewidmet. Je mehr Glykosylierungsstellen bei dem jeweiligen Protein vorhanden waren, desto kürzer wurden die Glykosylierungketten. Die Ergebnisse legen nahe, dass es eine Limitierung in der Verfügbarkeit von cytosolischer GDP-Mannose und der Glykosyltransferase-Kapazität gibt. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass der Metabolismus nicht nur die Rate der Proteinsynthese beeinflusst, sondern auch die Qualität des Proteins. In dieser Arbeit wurden beide Aspekte im Detail untersucht und so wurde ein Beitrag zum stetig wachsenden Wissensraum von P. pastoris geleistet.