Modeling MPN pathogenesis and the IFNα signaling pathway in murine bone marrow cells and patient derived iPS cells

Küstermann, Caroline; Zenke, Martin (Thesis advisor); Koschmieder, Steffen (Thesis advisor); Zimmer-Bensch, Geraldine Marion (Thesis advisor)

Aachen (2019, 2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Myeloproliferative Neoplasien (MPN) sind klonale Stammzellerkrankungen, die, wenn sie nicht behandelt werden, ein Versagen des hämatopoetischen Systems zur Folge haben. Ein Durchbruch in der MPN-Forschung war die Identifizierung von Treibermutationen, wie zum Beispiel BcrAbl in der chronisch myeloischen Leukämie (CML) und JAK2V617F in Polycythemia vera (PV). Ein weiterer Durchbruch, diesmal in der MPN-Behandlung, war die Entwicklung von Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI). Jedoch verursachte das Absetzen der TKI-Behandlung häufig ein Wiederauftreten der Leukämie, da die Leukämie induzierenden Stammzellen durch die TKI-Behandlung nicht beseitigt wurden. Interferonα (IFNα) wurde verwendet, bevor die TKI-Behandlung die First-In-Line-Therapie war. Studien an PV-Patienten zeigten eine Verringerung der JAK2V617F-Allelbelastung aufgrund der IFNα-Therapie. Der Signalweg im malignen Klon ist jedoch noch nicht gut verstanden. Im Gegensatz zu TKI zeigte die IFNα-Behandlung nach Absetzen der Therapie längere Remissionsphasen. Die Behandlung mit IFNα bei CML-Patienten zeigte jedoch schlechte Ergebnisse, während PV-Patienten sofort ansprachen. Untersuchungen an Knock-out-Mäusen und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) zeigten, dass der Interferon regulatorische Faktor 8 (IRF8) in CML herunterreguliert wird. Darüber hinaus wird davon ausgegangen, dass niedrige IRF8-Transkripte eine schlechte Prognose für die IFNα-Behandlung in der CML darstellen. Zunächst untersuchte ich den Einfluss von IRF8 auf die Pathogenese von CML und PV. Außerdem untersuchte ich den IFNα-Signalweg in PV und CML in Bezug auf IRF8 Expression. Zu diesem Zweck isolierte ich IRF8+/+ und IRF8-/- Knochenmarkszellen (BM) aus Mäusen und transduzierte diese Zellen mit BcrAbl oder JAK2V617F-Retroviren. Ich habe BcrAbl+ Zellen als Einzeltherapie in vitro mit Imatinib oder IFNα behandelt. Analysen per Durchflusszytometrie zeigten, dass BcrAbl+ Zellen unabhängig von Wachstumsfaktoren sind. Darüber hinaus zeigen IRF8-/- BcrAbl+ Zellen eine höhere Expansion und reagieren nicht auf die Imatinib-Behandlung. Überraschenderweise war der IFNα-Effekt IRF8 unabhängig, da das Wachstum von BcrAbl+ Zellen sowohl in IRF8+/+ als auch in IRF8-/- BM Zellen gehemmt wurde. BM Zellen, die mit JAK2V617F transduziert wurden, zeigten keine ausreichend hohe Transduktionseffizienz, um den IFNα Signalweg in diesem Zellsystem weiter zu untersuchen. Aus diesem Grund habe ich für spätere Experimente iPSC eingesetzt. Zur Untersuchung des IFNα Signalweges generierte ich JAK2V617F und JAK2 iPSC-Klone aus PBMNC von 3 PV Patienten und differenzierte diese in hämatopoetische Zellen. Während der hämatopoetischen Differenzierung von JAK2V617F und JAK2 iPSC-Klonen beobachtete ich einen Anstieg der CD34+ und CD235a+ Zellpopulation in JAK2V617F+ Zellen. Bei einer gerichteten Differenzierung mit Erythropoetin (EPO) konnte ich einen Anstieg der CD235a+ roten Blutkörperchen nachweisen und so die klinischen Merkmale des PV-Phänotyps in vitro modellieren. Um den IFNα-Signalweg aufzuklären, verifizierte ich zunächst, dass IFNAR1, IFNAR2, IRF7, IRF9 und STAT1 in iPSC abstammenden hämatopoetischen Zellen exprimiert wurden. In Genexpressionsanalysen wurde jedoch keine Hochregulierung von IFNα-Zielgenen wie IRF7 oder IRF9 beobachtet. Darüber hinaus schien die IFNAR1-Präsentation auf der Oberfläche von iPSC abstammenden hämatopoetischen Suspensionszellen zu fehlen. Bemerkenswerterweise zeigten Zellen aus der EB-Schicht einen höheren Prozentsatz an IFNAR1+ Zellen. Western Blot Analysen zeigten niedrige STAT1-Proteinspiegel. Zudem zeigten alle von iPSC abstammenden hämatopoetischen Zellen niedrige pSTAT1-Proteinspiegel nach IFNα Stimulation.