Optimization of itaconic acid production by U. maydis through metabolic engineering & adaptive laboratory evolution

Loevenich, Johanna; Blank, Lars M. (Thesis advisor); Wierckx, Nick (Thesis advisor)

1. Auflage. - Aachen : Apprimus Verlag (2019, 2020)
Buch, Doktorarbeit

In: Applied microbiology 14
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (XIV, 123 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Das stetige Wachstum der Weltbevölkerung führt zu einem bereits jetzt schon gigantischen und immer noch weiter wachsenden Bedarf an Nahrung, Energie, Brennstoffen und Chemikalien. Aufgrund der Endlichkeit fossiler Ressourcen, die überwiegend als Ausgangstoffe verwendet werden, ist ein Wechsel von Erdöl-basierten hin zu nachhaltigen, wirtschaftlich bio-basierten Produktprozessen unabdingbar, um auch in Zukunft die globalen Bedürfnisse decken zu können. Einen dieser Prozesse stellt die Produktion von Itaconsäure dar, welche als eine der Top 12 aus Biomasse hergestellten Mehrwert-Chemikalien vom DoE eingestuft wurde. Heutzutage erfolgt die biotechnologische Itaconsäure-Produktion im industriellen Maßstab mithilfe des filamentösen Pilzes Aspergillus terreus. Um die Probleme zu umgehen, die ein derartig wachsender Produktionswirt mit sich bringt, wird nach Alternativen gesucht. In diesem Zusammenhang gewann die Ustilaginaceae-Familie, einschließlich U. maydis, besondere Aufmerksamkeit.Zwei Strategien wurden nun im Laufe dieser Arbeit mit dem Ziel verfolgt, einen industriell einsetzbaren, gegenüber A. terreus konkurrenzfähigen Itaconsäure-Produktionswirt zu etablieren und die Itaconsäure-Produktionsleistung von U. maydis wesentlich zu verbessern: Metabolic Engineering und adaptive Laborentwicklung. Die Verkleinerung des vielfältigen Produktionsspektrums von U. maydis MB215 durch die Deletion der 2- Hydroxyparaconat-, Mannosylerythritollipid-, Ustilaginsäure- und Triacylglycerol-Biosynthese in Kombination mit der Hochregulierung von ria1, dem Regulator des für die Itaconsäure zuständigen Genclusters, führte zu einem erheblich gesteigerten Substratfluss in Richtung Itaconsäure-Biosynthese. Der Itaconsäure-Titer konnte so gegenüber des Wildtyps um das 10,2-fache gesteigert werden. Aufgrund der Hochregulierung des Cis-Aconitat/Malat-Antiporters mtt1 als Folge der ria1-Überexpression konnte gleichzeitig die Produktion von Malat, eines weiteren Nebenproduktes, um 84 % reduziert werden. Weitere Metabolic-Engineering-Strategien wurden in diesem Nebenprodukt-reduzierten U. maydis Stamm verfolgt: die Vermeidung filamentösen Wachstums durch die Deletion von fuz7 und die Überexpression des Gens mttA, welches für den mitochondrialen Tricarboxylat-Transporter in A. terreus codiert. Der designte ∆fuz7-Stamm wies deutlich verbesserte Produktionsparameter auf. Dies zeigte sich vor allem in einer um 25 % erhöhten Ausbeute aus Glucose. Mit der zusätzlichen Insertion von PetefmttA konnte dies noch gesteigert werden. Ein Klon mit dreifacher PetefmttA-Kopie erreichte einen Itaconsäure-Titer von 54 g L-1 und eine maximale Ausbeute von 0.64 gITA gglu-1, welche 89 % des theoretisch möglichen Wertes entspricht. Diese großartigen Verbesserungen hinsichtlich der Itaconsäure-Produktion bedeuten aber gleichzeitig ein erhöhtes metabolisches und osmotisches Stresslevel für die Zellen. Um diesem entgegenzuwirken sollte mithilfe von adaptiver Laborentwicklung ein Stamm generiert werden, welcher über eine erhöhte Toleranz gegenüber niedrigen pH-Werten und eine erhöhte Produktresistenz gegenüber Itaconsäure verfügt. Die Fitness von U. maydis konnte erheblich verbessert werden, was sich in Stämmen widerspiegelte, die in der Lage waren, auf pH 4 und in der Anwesenheit von 40 g L-1 Itaconsäure zu wachsen. Jedoch führte die Zusammenführung aller wichtigen, in dieser Arbeit identifizierten Modifikationen in einem Stamm zu einem Verlust dieser Toleranz. Vor allem die Deletion der Triacylglycerol-Produktion scheint die Zellen auf lange Sicht erheblich zu destabilisieren - machen diese Lipide doch den Hauptanteil an Energiereserven für die Zellen aus. Jedoch zeigen die Ergebnisse im Gesamten deutlich, dass die finalen Stämme großartige, weitreichend optimierte Produktionsparameter besitzen, die nah an das theoretische Maximum heranreichen. Diese Entwicklung macht U. maydis - neben A. terreus - zu einem industriell relevanten Produktionswirt für Itaconsäure.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie [161710]