Funktionale Analyse von Proteinen mit Dirigent- und Jacalin-ähnlichen Lektin-Domänen aus Reis und Arabidopsis thaliana im Rahmen der Pathogenresistenz

Esch, Lara; Schaffrath, Ulrich (Thesis advisor); Panstruga, Ralph (Thesis advisor)

Aachen (2019, 2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Pflanzen sind aufgrund ihrer sessilen Lebensweise zahlreichen biotischen und abiotischen Stressfaktoren ausgesetzt. Um auf die verschiedenen Umwelteinflüsse zu reagieren, haben Pflanzen differenzierte Abwehrmechanismen entwickelt. Die Einleitung einer Abwehrantwort beruht u. a. auf der spezifischen Erkennung konservierter Mikroben-assoziierter oder Schaden-assoziierter Moleküle, die bei einer Pathogeninfektion freigesetzt werden. Die Erkennung dieser Moleküle erfolgt in der Regel über membranständige Rezeptoren. Lektine sind Proteine mit spezifischen Kohlenhydrat- und Glykoprotein- bzw. Glykolipid-bindenen Eigenschaften und Lektin-Domänen können ein Bestandteil dieser Rezeptoren sein. In den letzen Jahren wurden vor allem nukleozytoplasmatische Lektine in Verbindung mit Abwehrreaktionen von Pflanzen gebracht. Das Jacalin-ähnliche Lektin OsJAC1 aus Reis, sowie dessen Orthologe TaJA1 aus Weizen und HvJAC1 aus Gerste, sind in eine Breitbandresistenz gegen verschiedene Pathogene involviert. Diese Proteine, die ausschließlich in Pflanzenarten der Familie der Poaceae gefunden wurden, bestehen aus einer N-terminalen Dirigent- und einer C-terminalen Jacalin-ähnlichen Lektin-Domäne (JRL) und werden als MonocotJRLs bezeichnet. Fusionsproteine wie diese MonocotJRLs haben spezifische Funktionen, die auf den Eigenschafen der beiden Domänen beruhen. Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Funktion der MonocotJRLs in der Pathogenresistenz unter besonderer Berücksichtigung von potentiellen Bindungspartnern der Lektin-Domäne näher charakterisiert werden. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob es Proteine mit einer MonocotJRL-ähnlichen Funktion in der dikotyledonen Modellpflanze Arabidopsis thaliana gibt. Zunächst wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die Funktion der Domänen der drei MonocotJRLs OsJAC1, TaJA1 und HvJAC1 in Bezug auf die Mehltauresistenz der Gerste konserviert ist und auch nach Austausch der Proteindomänen (domain swap) erhalten bleibt. In einem Yeast-two-Hybrid-Versuch (Y2H) wurde bestätigt, dass die artifiziell separierten Dirigent- und JRL-Domänen von OsJAC1 physikalisch miteinander interagieren. Zur näheren Charakterisierung der Funktion des Reisproteins OsJAC1 in der Mehltauresistenz von Gerste wurden in einem Split-Ubiquitin-basierten Y2H Versuch putative Interaktionspartner aus Gerste und Blumeria graminis f.sp. hordei identifiziert. In diesem Versuch wurde das Protein HORVU7Hr1G072050 aus Gerste mehrfach gefunden und sollte daher in einem unabhängigen Versuchsansatz mittels BiFC (Bimolekulare Fluoreszenzkomplementation) als Interaktionspartner von OsJAC1 verifiziert werden. Obwohl verschiedene Splicing-Varianten des Gens getestet wurden, ergaben sich keine Hinweise auf eine Interaktion des Proteins mit OsJAC1. Ob dies für weitere potentielle OsJAC1-Interaktionskandidaten aus dem Y2H-Versuch ebenfalls zutrifft, muss noch in weiterführenden Versuchen getestet werden. Die Mehrheit eukaryotischer Proteine besteht aus mehr als einer Domäne. Die Kombination einer Dirigent-Domäne mit einer JRL-Domäne ist jedoch spezifisch für die MonocotJRLs und kommt beispielsweise in Arabidopsis thaliana nicht vor. Basierend auf der ‚Rosetta Stone‘-Theorie, die die Möglichkeit der funktionalen Kooperation zweier Proteine in einem VII Organismus basierend auf dem Auftreten eines Fusionsproteins dieser beiden Proteine in einem anderen Organismus beschreibt, kann jedoch vermutet werden, dass es in Arabidopsis thaliana Einzeldomänen-Proteine gibt, die funktional miteinander kooperieren, um eine ähnliche Funktion wahrzunehmen. Aus diesem Grund wurde in dieser Arbeit eine Vielzahl von Dirigent- und JRL-Proteinen aus Arabidopsis thaliana untersucht. Versuche, in denen die Arabidopsis-Kandidaten transient in Gerste überexprimiert wurden, zeigten, dass die Proteinpaare AtJAX1 und AtDIR19, AtJAL39 und AtDIR11 sowie AtJAL2 und AtDIR11 die Resistenz der Gerste gegen Mehltau in einem ähnlichen Umfang wie OsJAC1 steigern können. AtJAX1 und AtDIR19 befinden sich im Arabidopsisgenom direkt nebeneinander auf Chromosom 1. In einem BiFC-Experiment in Nicotiana benthamiana konnte jedoch keine physikalische Interaktion der beiden Proteine beobachtet werden. Auch die Komplementation des Arabidopsis-Ökotyps Col-0, der nur eine verkürzte Version des AtJAX1 exprimiert, mit dem vollständigen AtJAX1-Protein hatte keinen Einfluss auf die Resistenz der Pflanzen gegen Mehltau. Die durch die Überexpression von AtJAX1 und AtDIR19 bedingte Mehlaureistenz in Gerste unterliegt somit wahrscheinlich einem anderen Mechanismus als die MonocotJRL-vermittelte Resistenz. Für diese These spricht auch das Ergebnis einer Überexpression der MonocotJRLs OsJAC1 bzw. TaJA1 und HvJAC1 in Arabidopsis thaliana, bei dem ebenfalls kein Resistenz-steigernder Effekt gegen Mehltau beobachtet werden konnte. Zur Analyse des Kandidatenpaars AtJAL39 und AtDIR11 wurden bereits Lokalisationsstudien, die auf eine Lokalisation im Zytoplasma hindeuten, durchgeführt. Für die weitere Charakterisierung der Funktion der Dirigent- und JRL-Proteine aus Arabidopsis thaliana sowie zur Bestätigung der hypothetischen funktionellen Kooperation der Proteine, stellt die Identifikation von Interaktionspartnern einen wichtigen nächsten Schritt dar.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie [161510]