Exploring the CRISPR-Cas9 potential to revert beta-lactam resistance in clinically relevant gram-negative bacteria

• Untersuchungen zum Potential des CRISPR-CAS9-Systems zur Umkehr von Beta-Lactam Resistenzen in klinisch relevanten gram-negativen Bakterien

Tagliaferri, Thaysa Leite; Horz, Hans-Peter (Thesis advisor); Panstruga, Ralph (Thesis advisor); Guimaraes, Flavio (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020. - Dissertation, Universidade Federal de Minas Gerais, 2020

Kurzfassung

Die Krise der Antibiotikaresistenz (AMR) erfordert dringend Gegenmaßnahmen, um die Verbreitung von Plasmiden, die Resistenzgene tragen, zu verringern. Von besonderer Bedeutung sind opportunistische Pathogene aus der Familie der Enterobacteriacea. Ein innovativer Ansatz zur Bekämpfung der AMR ist die Verwendung des CRISPR-Cas9-Systems, das kürzlich zur Plasmid-Entfernung in definierten Stämmen von Escherichia coli eingesetzt wurde. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses System weiter genutzt, um das blaTEM-1-Resistenzgen, das sich auf einem Plasmid mit hoher Kopienzahl (d.h. > 100 Kopien / Zelle) befindet, gezielt zu inaktivieren. Zudem wurden die blaTEM-1- und blaKPC-Gene, die beide in multi-resistenten Bakterien vorkommen, direkt bei klinischen Isolaten mittels CRISPR-Cas9 adressiert. Es ist bekannt, dass klinische Enterobacteriaceae-Stämme mehrere Resistenzmechanismen besitzen, die die Effizienz des CRISPR-Cas9-Systems beeinträchtigen könnten. Außerdem hängt die Ausprägung der Resistenz direkt von der Plasmidkopienzahl ab. Ziel dieser Arbeit war es daher, die CRISPR-Cas9-Technologie unter herausfordernden Bedingungen weiter zu erforschen, insbesondere wenn Plasmide mit hoher Kopienzahl und klinische Bakterien im Visier sind. Diese Dissertation soll dazu beitragen, die möglichen Szenarien zu klären, die mit der Anwendung des CRISPR-Cas9-Systems bei der Resistenzreduzierung erzielt werden, um dieses Technik als alternative Methode zur Bekämpfung der AMR zu etablieren. Unter Verwendung unabhängiger Techniken wie fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS), qPCR und Fluoreszenzmikroskopie wurden bei der Insertion von CRISPR-Cas9 in den Zellen reduzierte Plasmidmengen nachgewiesen. Obwohl eine bestehende Plasmidintegrität nachgewiesen werden konnte, wurden Sequenzveränderungen im blaTEM-1-Gen nachgewiesen, was zu einer Funktionsstörung des Genprodukts und daher zu einem antibiotikasensitiven Stamm führte. In einem klinischen Isolat von E. coli wurde eine vollständige Plasmid-Clearance und damit einher gehend eine Resensibilisierung gegenüber fünf Beta-Lactam-Antibiotika erzielt. Die Wiederverwendbarkeit dieser Antibiotika konnte durch Infektion von Galleria mellonella-Larven mit einer mit CRISPR-Cas9-behandeltem E. coli-Population, im Gegensatz zur Infektion mit einem nicht modifizierten klinischen Isolat bestätigt werden. Die Antibiotika-Sensitivität konnte auch in einem klinischen Isolat von Enterobacter cloacae und in geringerem Maße in Klebsiella variicola erhöht werden, die beide allerdings auch das blaCTX-M-Gen enthielten. Beim Wechsel des CRISPR-Cas9-Targets auf das blaKPC-Gen wurde bei 63% der gewonnenen Klone des klinischen Isolats von Klebsiella oxytoca eine Resistenzreduktion gegenüber Imipenem auf intermediär erreicht. Interessanterweise wurde sowohl in noch resistenten als auch in intermediären Klonen eine Verringerung der Plasmidkopienzahl sowie der blaKPC-Genexpression beobachtet. Darüber hinaus war die Wachstums-Fitness ebenfalls signifikant verringert, wenn entweder intermediäre oder noch resistente Klone mit einer nicht mit CRISPR-Cas9 behandelten Kontrolle verglichen wurden. Allerdings konnte in diesem Fall keine In-vivo-Auswirkung von CRISPR-Cas9 beobachtet werden, wenn Imipenem zur Behandlung von G.-mellonella-Larven eingesetzt wurde, welche mit verschiedenen Klonen von K. oxytoca infiziert worden waren. Schließlich wurde ein funktionsfähiges CRISPR-Cas9-System über Bakteriophagen entwickelt, das die Anwendungsmöglichkeiten der Technik erweitert. Zusammenfassend zeigten die Daten, dass die Ziel-Bakterien der CRISPR-Cas9-basierten Manipulation nicht ausreichend ausweichen konnten und somit den resistenten Phänotyp z.B. mittels Plasmidamplifikation nicht aufrechterhalten konnte. Trotz der vielfältigen Herausforderungen, die klinische Isolate mit sich bringen, führte die Störung des Resistenzgens zu einer deutlichen Verringerung der Resistenz. Eine Überexpression22der Effluxpumpen oder Veränderungen der Porine in den klinischen Isolaten verhinderten, falls sie aufgetreten waren, nicht die herbei geführte Verringerung der Resistenz. Insgesamt ergeben sich verschiedene Resultate bei der CRISPR-Cas9-basierten Interferenz mit einem Resistenzgen, nämlich Plasmid-Clearance; Zerstörung des Resistenzgens; sowie eine Verringerung der Plasmidkopienzahl, welche die Effektivität des horizontalen Gentransfer resistenter Plasmide verringert. Angesichts der Tatsache, dass sich antimikrobielle Resistenzen weltweit verbreitet haben und schwerwiegende Auswirkungen auf das Leben von Menschen haben, liefern die Ergebnisse dieser Studie wichtige Details zu den möglichen Ergebnissen, wenn CRISPR-Cas9 als alternatives Strategie zur Verringerung der Resistenz bei klinisch relevanten Krankheitserregern eingesetzt wird.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Molekulare Zellbiologie der Pflanzen [161920]
• [525500-2]