Metabolic engineering of Pseudomonas taiwanensis VLB120 for sustainable production of 4-Hydroxybenzoate

Lenzen, Christoph; Blank, Lars M. (Thesis advisor); Wierckx, Nick (Thesis advisor)

1. Auflage. - Aachen : Apprimus (2020)
Buch, Doktorarbeit

In: Applied microbiology 17
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (XVIII, 153 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Die aromatische Substanz 4-Hydroxybenzoat und ihre Derivate, die Parabene, finden breite Anwendung im alltäglichen Leben. Derzeitige Produktionswege für Aromaten wie 4-Hydroxybenzoat beruhen hauptsächlich auf chemischen Prozessen und benötigen hohen Einsatzan Energie und fossilen Ressourcen. Aufgrund der schwindenden Verfügbarkeit jener und des steigenden Bedarfs an Aromaten sowie nicht umweltfreundlichen Synthesewegen existiert eindringender Bedarf an effizienteren und nachhaltigen Produktionsprozessen. Die vorliegende Arbeit behandelt die Entwicklung eines Pseudomonas-basierten Ganzzellbiokatalysators für die Biokonversion von 4-Hydroxybenzoat aus erneuerbaren Rohstoffen wie Glucose oder Glycerin. Neben dem bemerkenswerten und vielseitigen Stoffwechsel dieser Organismen und der nativen hohen Toleranz gegenüber toxischen Substanzen wie organischen Lösungsmitteln wurde die Spezies Pseudomonas taiwanensis VLB120 als Produktionswirt ausgewählt, da sie die natürliche Fähigkeit besitzt, C5-Zucker wie Xylose zu metabolisieren und sie als nicht-pathogener Organismus angesehen wird. Frühere Versuche zur biotechnologischen Produktion von 4-Hdroxybenzoat mit Pseudomonaden oder anderen Wirten waren zwar erfolgreich, resultierten aber meist in geringen Ausbeuten oder benötigten aufgrund von Auxotrophien die Supplementierung zusätzlicher Metabolite. Daher war es das Ziel dieser Arbeit, die Bioproduktion von 4-Hydroxybenzoat in hoher Ausbeute und nur anhand einer spezifischen Kohlenstoffquelle zu ermöglichen. Um das gesamte Potenzial des Metabolic Engineering auszuschöpfen, wurden für die Stammentwicklung rationale sowie nicht-rationale Strategien angewandt. Durch Einführung eines heterologen Produktionsweges ausgehend von Tyrosin, die Eliminierung und Herunterregulierung konkurrierender Stoffwechselwege und die Überexpression von Schlüsselgenen produzierte der Stamm P. taiwanensis VLB120 CL4.3 4-Hydroxybenzoat mit einer C-mol Ausbeute von 19,0% aus Glucose, während der Stamm P. taiwanensis VLB120 CL3.3 während des Wachstums auf Glycerin in Batchkultivierung 29,6% erreichte und einen Titer 9,9 g l-1 in Fed-batch Fermentationen. Ein nicht-rationaler Ansatz zur verbesserten Produktion von 4-Hydroxybenzoat wurde durch zufällige chemische Mutagenese und anschließender Hochdurchsatzdurchmusterung mittels Durchflusszytometrie mithilfe eines fluoreszenzbasierten Biosensors durchgeführt. Der beste identifizierte Stamm, P. taiwanensis VLB120 CL2 gfp2 P2H08, produzierte 31% mehr 4-Hydroxybenzoat als der nicht mutierte Stamm. Obwohl weiteres rationales Engineering dieses Stammes nicht in verbesserter Produktion resultierte, dürften die eingeführten Mutationen dennoch wertvolle Einblicke für zukünftige Engineering-Ziele gewähren. Weiterhin wurde eine Verbesserung der 4-Hydroxybenzoat-Produktion durch die Nutzung des Metabolic-Demand-Konzepts erzielt. Dabei wurden die Hauptwege zur Bereitstellung von Acetyl-CoA basierend von Glucose disruptiert, während der Acetyl-CoA-bereitstellende Produktionsweg für 4-Hydroxybenzoat intakt gelassen wurde, um eine wachstumsgekoppelte Produktion zu gewährleisten. Auf Glucose als alleiniger Kohlenstoffquelle produzierte Stamm P. taiwanensis VLB120 CL5.4 4-Hydroxybenzoat mit einer C-mol Ausbeute von 21.0%, was die Vermutung stützt, dass das Metabolic-Demand-Konzept für eine effizientere Produktion von Aromaten genutzt werden kann. Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse unterstreichen das große Potenzial von P. taiwanensis VLB120 als Wirt für nachhaltige, industrielle Biokonversion von Aromaten und stellen die Basis für weiteres Engineering dar, um die biotechnologische Produktion von wertvollen Substanzen als vielversprechende Alternative zu aktuellen chemischen Produktionswegen voranzutreiben.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie [161710]