Mast cell activation by supra-optimal antigen concentrations - a promising condition to identify novel regulators of FcεRI signaling

• Mastzellaktivierung mit supraoptimalen Antigenkonzentrationen - eine vielversprechende Bedingung zur Identifikation neuer Regulatoren der FcεRI-Signaltransduktion

Gast, Mathias; Huber, Michael (Thesis advisor); Lüscher, Bernhard (Thesis advisor)

Aachen (2019, 2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2019

Kurzfassung

Die Aktivierung des hochaffinen Rezeptors für IgE (FcεRI) folgt einer glockenförmigen Dosis-Wirkungs-Kurve. Nach Stimulation mit einer supra-optimalen Antigenkonzentration, werden die Effektorantworten der Mastzelle durch inhibitorische Moleküle herunterreguliert. Bei diesem Prozess sind unter anderem die SH2-enthaltende Inositol-5’-Phosphatase SHIP1 und die SRC-Kinase LYN von zentraler Bedeutung. Um weitere Proteine zu identifizieren, die an einem negativregulatorischen Signalosom beteiligt sind, haben wir ein Screening durchgeführt, in dem wir nach Proteinen suchten, deren Tyrosinphosphorylierungsmuster dem von SHIP1 entspricht. Die Phosphorylierung der Tyrosinreste dieser, für die Negativregulation entscheidenden, Lipidphosphatase steigt analog zur Antigenkonzentration an und ist am stärksten ausgeprägt bei supra-optimalen Konzentrationen. Wir fanden heraus, dass der niedrigaffine IgG-Rezeptor FcγRIIB nach Antigenstimulation ebenfalls phosphoryliert wird. Diese Phosphorylierung ist wie bei SHIP1 unter supra-optimalen Bedingungen am stärksten ausgeprägt und die Konsequenz einer passiven, antigen- bzw. IgE-abhängigen sowie progressiven Kolokalisation von FcεRI und FcγRIIB. Sie ist unabhängig von IgG und erfolgt nach der supra-optimalen Quervernetzung von FcεRI durch die Tyrosinkinase LYN. Dies hat die Rekrutierung von SHIP1 mittels des FcγRIIB ITIM zur Folge, was den beteiligten Tyrosinrest (Y309) im ITIM vor unmittelbarer Dephosphorylierung bewahrt. Die Analyse FcγRIIB-defizienter BMMCs ergab keine eindeutige Veränderung im Phänotyp nach Antigenstimulation. In Abwesenheit von FcγRIIB waren einerseits sowohl die SHIP1-Phosphorylierung signifikant verringert als auch die Kalziummobilisierung verstärkt, was für eine Beteiligung des Rezeptors an der SHIP1-abhängigen supra-optimalen Negativregulation der Mastzellaktivierung spricht. Andererseits war in diesen Zellen die Degranulierung nicht und die IL-6 Produktion nur geringfügig erhöht. Insgesamt zeigen unsere Daten das LYN/FcγRIIB/SHIP1 Signalosom im Kontext der FcεRI Aktivierung, insbesondere bei supra-optimalen Antigenkonzentrationen. Die Tatsache, dass nicht allein der FcγRIIB die Aktivierung bzw. Tyrosinphosphorylierung von SHIP1 gewährleistet, unterstreicht die besondere Bedeutung dieses Proteins für die Regulation der FcεRI-abhängigen Mastzellaktivierung. Weiterhin zeigt dies die Notwendigkeit, die Rekrutierung von SHIP1 engmaschig durch andere Moleküle abzusichern, um die Funktion der Phosphatase zu gewährleisten. In die Einleitung von Mastzellantworten durch FcεRI und KIT sind ähnliche Signalwege und Mechanismen, wie etwa der PI3K-Signalweg, der MAPK-Signalweg und auch die Mobilisierung von zellulärem Kalzium einbezogen. Während die separate Stimulation der beiden Rezeptoren zu unterschiedlichen Zellantworten führt, bewirkt eine Kostimulation beider Rezeptoren mit SF und Ag eine KIT-abhängige Verstärkung der durch FcεRI ausgelösten Degranulierung und Zytokinproduktion. Um diesen synergistischen Effekt auslösen zu können, müssen die Signalprozesse beider Rezeptoren integriert werden. Vor dem Hintergrund des stark ausgeprägten strukturellen Synergismusses zwischen der Signaltransduktion von FcεRI und KIT, beschreiben wir die antigenabhängige Tyrosinphosphorylierung und Internalisierung von KIT in Abwesenheit von SF. Wir beobachteten, dass die Stimulation von Mastzellen mit Antigen die Phosphorylierung von KIT an Y719 zur Folge hat. Die Phosphorylierung wird durch LYN katalysiert und ihre Ausprägung ist abhängig von der Antigenkonzentration. Da die intrinsische Tyrosinkinaseaktivität für die Entstehung der Phosphorylierung nicht benötigt wird, kann man vermuten, dass die antigenabhängige Phosphorylierung von Y719 höchst wahrscheinlich auch unabhängig von einer KIT-Dimerisierung ist. Diese wird klassischerweise durch die Stimulation mit SF hervorgerufen und von einer Autophosphorylierung an Y719 begleitet. Weiterhin deuten unsere Daten darauf hin, dass die SF-unabhängige Rekrutierung von KIT möglicherweise einen negativen regulatorischen Einfluss auf frühe Effektormechanismen der antigengesteuerten Mastzellantwort ausübt. Der Vergleich von KIT-defizienten und WT BMMCs zeigte, dass die Freisetzung von β-Hexosaminidase nach Antigenstimulation in Abwesenheit von KIT signifikant erhöht ist, insbesondere bei supra-optimalen Antigenkonzentrationen. Im Gegensatz dazu erscheint die antigenabhängige Produktion von Zytokinen unbeeinträchtigt.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• [513000-3]