Entwicklung und Optimierung eines Enzymmodulsystems zur Synthese von Hyaluronsäure

• Development and optimization of an enzyme module system for the synthesis of hyaluronic acid

Eisele, Anna; Elling, Lothar (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

In dieser Arbeit wurde ein neuartiges Enzymmodulsystem zur in vitro-Synthese von HA aus Saccharose und GlcNAc mit in situ-Produktion und -Regeneration von Nukleotidzuckern entwickelt. Es besteht aus zwei Enzymmodulen für die Synthese von UDP-GlcA und UDP-GlcNAc als Substrate für das polymerisierende Enzym HAS, welches Bestandteil des dritten Enzymmoduls ist. Die Multi-Enzym-Kaskaden-Reaktionen wurden simultan in Form einer Eintopfsynthese durchgeführt. Die Analyse der Reaktionen erfolgte mit Hilfe der MP-CE als Hochdurchsatzmethode mit Detektion der Nukleotide und Nukleotidzucker. Für die Analytik des HA-Produkts wurde zusätzlich eine Kombination aus Agarose-Gelelektrophorese, SEC-RALS/LALS und CTAB-Trübungstest verwendet. Mit Hilfe dieser Methoden wurden einzelne Enzyme, Enzymmodule und deren Kombinationen sukzessiv charakterisiert. Dabei wurden Reaktionsparameter wie Enzymkonzentration, Substratkonzentration, Substratverhältnis, Metall-Cofaktoren, Kinetik und Inhibition untersucht und optimiert. Besonderer Fokus lag auf dem Enzym pmHAS1-703-His6, über welches neue Erkenntnisse gewonnen werden konnten. Es konnte gezeigt werden, dass pmHAS1-703-His6 durch das Substrat UDP-GlcA in Konzentrationen von über 8 mM inhibiert wird und einen sehr hohen Km-Wert von 23,4 mM für das zweite Substrat UDP-GlcNAc aufweist. Basierend darauf konnte das UDP-Zucker-Verhältnis als Mittel zur Kontrolle der pmHAS1-703-His6-Reaktion eingesetzt werden. Des Weiteren konnte K+ als neuer, monovalenter Koaktivator der pmHAS1-703-His6-Reaktion identifiziert werden. Zusammen mit divalenten Metallionen erhöht K+ die Polymerisationsrate der pmHAS1-703-His6 und das Molekulargewicht der produzierten HA. Insgesamt konnte die Synthesedauer mit pmHAS1-703-His6 ausgehend von Nukleotidzuckern im Vergleich zur Literatur auf 6-8 h verkürzt und das Mw der HA auf über 3 MDa erhöht werden. Durch Verwendung unterschiedlicher Regenerationssysteme für UDP-GlcA und UDP-GlcNAc lässt sich deren Regeneration im EMS unabhängig voneinander ansteuern. Die durch SuSy vermittelte UDP-GlcA-Regeneration erwies sich als besonders vorteilhaft aus ökonomischer und aus kinetischer Sicht. Damit ließ sich ein günstiges Nukleotidzucker-Verhältnis einstellen. Durch Nutzung einer katalytischen UDP-Konzentration konnte bei gleichzeitiger Minimierung der UDP-Kosten die schnellste HA-Synthese und das höchste Mw der HA mit dem EMS und UDP-GlcA-Regeneration erzielt werden. Aus 10 mM GlcNAc, 200 mM Saccharose und 0,02 mM UDP konnten auf diese Weise nach 9 h 4 mg/mL HA-Polymer mit 2,3 MDa synthetisiert werden. Die Regeneration von UDP-GlcNAc erwies sich hingegen als unvorteilhaft aufgrund des hohen Km-Werts der pmHAS1-703-His6 für UDP-GlcNAc und resultierte in einem geringeren Mw nach einer deutlich langsameren Synthese. Aufgrund der zusätzlich hohen Kosten für das PEP/PK Regenerationssystem wurde die UDP-GlcNAc-Regeneration als nicht erstrebenswert befunden. Es wurde dennoch eine prinzipielle Machbarkeit der Regeneration beider Nukleotidzucker demonstriert. Zuletzt konnte gezeigt werden, dass die lösliche pmHAS1-703-His6 flexibel durch das Membranenzym szHAS ersetzt werden kann. Hierzu wurden HAS-produzierende E. coli-Zellen anstatt isolierter HAS als Biokatalysator eingesetzt. Insgesamt wurden in dieser Arbeit präzise, optimierte Reaktionsbedingungen für die Synthese von hochmolekularer HA mit pmHAS1-703-His6 definiert. Damit wurde im analytischen Maßstab die Grundlage für einen potentiellen, enzymatischen HA-Produktionsprozess geschaffen und dessen Upstream Processing im Labormaßstab etabliert. Als nächste Schritte müssen ein effizientes Scale-up und Downstream Processing zur Aufreinigung des HA-Produkts entwickelt werden. Wenn nicht nur die HAS, sondern alle Enzyme des EMS in Form von z. B. permeabilisierten Zellen eingesetzt werden könnten, würde eine äußerst kostengünstige Methode für die HA-Produktion aus nachhaltigen Substraten zur Verfügung stehen. Ferner ist eine Erweiterung des EMS auf die Synthese von anderen GAGs möglich, z. B. Chondroitin durch Austausch des UDP-GlcNAc-EM durch das UDP-GalNAc-EM. Eine Weiterentwicklung des Systems zu einem Enzymreaktor ist ebenfalls denkbar. Bereits jetzt kann das EMS als kleinmaßstabige Alternative zur Herstellung von HA genutzt werden oder als Modell für das Metabolic Engineering eines HA-Produzenten dienen.

Einrichtungen

• Lehr- und Forschungsgebiet Biomaterialien [162820]
• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]