Protein engineering of a sulfotransferase and a monooxygenase for the synthesis of high-value chemicals

Ji, Yu; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Elling, Lothar (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Das Streben nach Nachhaltigkeit (weniger Abfall und weniger Ressourcennutzung) ist ein globales Thema, das mit ökologischen, wirtschaftlichen und sozialen Belangen zusammenhängt. Enzyme als biologisch abbaubare Katalysatoren spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung nachhaltiger Technologien. Die enzymatische Katalyse als ein sichereres Verfahren im Vergleich zur chemischen Katalyse, erfolgt in der Regel mit hoher katalytischer Effizienz und Spezifität unter milden Reaktionsbedingungen unter Verwendung weniger gefährlicher und toxischer Chemikalien. In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Klassen von Enzymen (Transferasen und Oxidoreduktasen) für die Entgiftung von phenolischen Verbindungen sowie für die Produktion von biologisch abbaubaren Tensiden entwickelt. Katechole (in der chemischen Industrie in großem Umfang verwendet) sind in der Umwelt reichlich vorhanden und verursachen beim Menschen gesundheitliche Probleme, z. B. Gefäßverengung, Nierenröhrendegeneration, Leberfunktionsstörungen und Neuro-degeneration. Die Sulfatierung ist ein wichtiger Weg zur Entgiftung von Xenobiotika und Endobiotika einschließlich der Katechole. Metaboliten wie Katecholsulfate wirken in unserem Körper als wichtige Antioxidantien und haben oft entzündungshemmende Eigenschaften. Darüber hinaus werden sie als Biomarker zur Überwachung von Krankheiten wie Parkinson, Herz-Kreislauf-Erkrankungen, Harnwegsinfektionen, Candidämie und verschiedenen Formen von Krebs eingesetzt. Aufgrund ihrer hohen biologischen Relevanz besteht ein zunehmendes Interesse an der Synthese von Katecholsulfaten. Die enzymatische Umsetzung von Katecholen mit Arylsulfotransferase ist ein synthetisch attraktiver, umweltfreundlicher und nachhaltiger Weg zur regio-/chemoselektiven Sulfatierung von Katecholen. Ein zweistufiges p-NPS-4-AAP-Screening-System für die gelenkte Evolution der Arylsulfotransferase B (ASTB) wurde in 96-Well-Mikrotiterplatten entwickelt, um die Effizienz des Sulfattransfers zu den Katecholen zu verbessern. Die Optimierung ergab einen Variationskoeffizienten von unter 15 % für das p-NPS-4-AAP-Screening-System. Die Validierung des etablierten Screeningsystems erfolgte durch eine gelenkte Arylsulfotransferase-Evolution in Richtung 3-Chlorocatechol, die die vorteilhafte Variante ASTB-M5 (V430A) ergab und eine bis zu 2,4-fach erhöhte Wechselzahl und eine deutlich verbesserte Sulfat-Stöchiometrie von ASTB-M5 (von 29 % auf 58 %) zeigte. Das Reengineering von loop12 und loop13 der Arylsulfotransferase B (ASTB) wurde durchgeführt, um die Sulfat-Transfereffizienz von sechs Katecholen zu verbessern. Die erhaltenen ASTB-Varianten wurden in einer KnowVolution-Kampagne mit der Zufallsmutagenese-Methode SeSaM und der Multi-Site-Sättigungsmethode OmniChange generiert. Die katalytische Aktivität (kcat) und die katalytische Effizienz (kcat/KM) der endgültigen Variante ASTB-OM2 (Q191Y/Y218W/L225V) wurden für alle sechs untersuchten Katechole im Vergleich zu ASTB-WT verbessert (z. B. 13,6-fache Verbesserung von kcat für 3-Bromocatechol). Die HPLC-MS-Analyse bestätigte die verbesserte Sulfatstöchiometrie von ASTB-OM2 mit einer Transfereffizienz von bis zu 87 % für 3-Fluorocatechol im Vergleich zu 18 % für ASTB-WT. Ein molekulares Verständnis der verbesserten Sulfatierungsaktivität von ASTB-OM2 wurde durch molekulare Andockstudien erreicht, und die Elektroneneffekte von Katecholsubstituenten wurden mit Hilfe der Hammett-Gleichung analysiert. Die finale Variante ASTB-OM2 wurde auch für die Sulfatierung wichtiger pharmazeutischer Verbindungen eingesetzt. Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) ist ein in der Natur weit-verbreitetes kationisches Tensid. Die wichtigsten Parameter für den Einsatz von kationischen Tensiden in der Industrie sind neben den Kosten für die Verbindungen die biologische Abbaubarkeit und die Löslichkeit der Tenside. Der biologische Abbau von CTAB erfordert im ersten Schritt eine Hydroxylierung, die geschwindigkeitsbegrenzend und entscheidend für die Löslichkeit in Wasser ist. Heutzutage bestehen Bolaform-Tenside (wie z. B. hydroxylierte CTAB) aus zwei hydrophilen Gruppen, die durch eine hydrophobe Spacerkette getrennt sind, und zogen aufgrund ihrer reduzierten Mizellengröße und ihrer hervorragenden Solubilisierungseigenschaften das Interesse von Industrie und Wissenschaft auf sich. Die enzymatische Hydroxylierung von CTAB durch Monooxygenase P450 BM3 ist ein nachhaltiger Weg für die Synthese von biologisch abbaubaren Bolaform-Tensiden mit Hydroxylierung von CTAB. Die OmniChange-Multi-Site-Mutagenese wurde angewandt, um die Substrat-Spezifität der P450 BM3 für die Hydroxylierung von CTAB durch gleichzeitige Mutagenese von vier zuvor bekannten Positionen (R47, Y51, F87 und L188) zu reengineeren. Insgesamt wurden 1740 Klone aus der P450 BM3 OmniChange-Bibliothek mit dem NADPH-Abnahme-Assay und dem H2O2-Detektionsassay durchgemustert. Mehrere verbesserte P450 BM3-Varianten wurden identifiziert und schließlich wurden vier Varianten kinetisch hinsichtlich der CTAB-Hydroxylierung auf der Basis von Leistung und Kopplungseffizienz charakterisiert. Die P450 BM3-Variante P3A8 (R47E/Y51M/F87V/L188E) zeigte eine initiale Aktivität (64,9 ± 4,8 s-1, 13,5-fach erhöhte Aktivität im Vergleich zum Wildtyp P450 BM3), die im Bereich der spezifischen Aktivität für sein natürliches Fettsäuresubstrat (Palmitinsäure, 32-122 s-1) liegt, und zeigte eine hohe Kopplungseffizienz (92,5 %), während der Wildtyp P450 BM3 eine sehr geringe Kopplungseffizienz (0,5 %) zeigte. Der HPLC-MS/MS-Nachweis bestätigte, dass P3A8 und P2E7 (R47D/Y51L/F87V/L188A) 13- und 35-fach mehr 2-hydroxylierte CTAB bilden als P450 BM3. Darüber hinaus wurden für alle vier untersuchten P450 BM3-Varianten (bis zu einer Ausbeute von 77 %; P3A8) dihydroxylierte CTAB-Produkte nachgewiesen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]