Protein engineering of the monooxygenase P450 BM3 toward improved performance in allylic hydroxylation

• Protein-Engineering der Monooxygenase P450 BM3 hinsichtlich verbesserter Leistung in allylischer Hydroxylierung

Gärtner, Anna; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Elling, Lothar (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Keto-Isophoron ist ein Zwischenprodukt für die Synthese von Aroma- und Duftstoffen, Pharmazeutika und Nährstoffen wie Vitamin E. Die übliche chemische Umwandlung erfolgt über einen Isomerisierungsschritt mit geringer Ausbeute von α- zu β-Isophoron. Cytochrom P450 BM3 Monooxygenase aus Bacillus megaterium wurde als ein alternativer, biologischer Katalysator für die Oxidation von α-Isophoron identifiziert. Der Wildtyp fügte ein einzelnes Sauerstoffatom aus molekularem Sauerstoff in eine C-H-Bindung ein, wodurch hauptsächlich 4-Hydroxyisophoron entstand, eine Vorstufe von Keto-Isophoron. Semi-rationales Protein-Engineering von P450 BM3 wurde angegangen, um Einschränkungen in der Aktivität, Regioselektivität und Kopplungseffizienz bei der allylischen Oxidation von α-Isophoron zu überwinden und einen robusten Biokatalysator für die industrielle Anwendung zu generieren. Zur effizienten Identifizierung nützlicher Varianten innerhalb der erzeugten Mutantenbibliotheken wurde ein produktspezifisches Screening-System etabliert. Die Multiplex-Kapillarelektrophorese (MP-CE) ermöglichte den gleichzeitigen Nachweis und Quantifizierung des Zielprodukts sowie der Nebenprodukte im 96-Well-Format. Die Trennung der Isophoron-Derivate wurde in einem mizellaren Puffersystem mit einer geringen Standardabweichung (12%) und einem breiten linearen Detektionsbereich (0,125 mM bis mindestens 20 mM) erreicht. Die neue MP-CE-Plattform ermöglichte die Identifizierung robuster Varianten mit einer 3,5-fach höheren Genauigkeit als der häufig durchgeführte NADPH-Oxidation-Assay. Das Screening von (Multi-)Sättigungsbibliotheken führte zur Identifizierung der für die 4-Hydroxyisophoron-Bildung vorteilhaften Substitutionen R47S/Y51W/I401M (M2), V78N, F87V und I263M. Anschließend wurde die Variante M2 als Vorlage verwendet und die drei weiteren vorteilhaften Substitutionen in allen möglichen Kombinationen eingefügt. Das Protein-Engineering führte zur Bildung der Variante M2 V78N, die im Vergleich zum WT einen 3,82-fach erhöhten 4-Hydroxyisophoron-Titer, eine 1,27-fach verbesserte Kopplungseffizienz und eine 21,08-fach erhöhte NADPH-Oxidationsrate aufwies. Die katalytische Leistung der Variante M2 V78N wurde mit der Variante RLYFIP verglichen, die zuvor als wirksamer Katalysator für die α-Isophoron-Oxidation veröffentlicht wurde. Darüber hinaus wurden zwei rationale Engineering-Strategien durchgeführt, die die Erhöhung der Hydrophobizität in einem Proteinkanal von P450 BM3 und die Modulation des Elektronentransferpfades beinhalteten, sowie die Einführung von inerten Decoy-Molekülen zur Steigerung der Leistung von P450 BM3 untersucht. Alternative Strategien resultierten nicht in einer Verbesserung der 4-Hydroxyisophoron-Bildung durch P450 BM3, führten jedoch zu einem Informationsgewinn über Voraussetzungen und notwendige Änderungen für eine erfolgreiche Leistungsoptimierung. Eine Überoxidation von 4-Hydroxyisophoron durch P450 BM3-Varianten zu dem entsprechenden Keton wurde teilweise beobachtet, jedoch mit geringen Ausbeuten. Daher wurde die Fähigkeit einer Reihe von Oxidoreduktasen, nämlich Alkoholdehydrogenasen und Laccasen, zur Bildung von Keto-Isophoron validiert. Beide Ansätze führten zur Identifizierung eines Enzyms aus jeder untersuchten Enzymklasse. Die Laccase aus Trametes versicolor zeigte die beste Leistung mit N-Hydroxylgruppen-Mediatoren und erreichte Keto-Isophoron-Ausbeuten von bis zu 20%, während ADH-R 45,5% bei pH 8,5 und 25,7% bei pH 7,5 erzielte. In Kombination mit P450 BM3 waren die Ausbeuten des Doppeloxidationsprozesses ausgehend von α-Isophoron mit 2,3% (Laccase) bzw. 8,8% (ADH-R) jedoch ziemlich gering. Das Laccase-Mediatorsystem stellt jedoch eine neue Kombinationsmöglichkeit für zweistufige Prozesse mit P450 BM3 dar. Die katalytische Analyse von ADH-R offenbarte entscheidende Punkte für die Reaktionsoptimierung zum Erhalt eines effizienten Systems für die einstufige Eintopfsynthese von Keto-Isophoron mit gleichzeitiger Kofaktorregenerierung.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]