Development of synthetic biology tools for Pseudomonas putida

• Entwicklung von Werkzeugen der synthetischen Biologie für Pseudomonas putida

Köbbing, Sebastian; Blank, Lars M. (Thesis advisor); Wierckx, Nick (Thesis advisor)

1. Auflage. - Aachen : Apprimus Verlag (2020)
Buch, Doktorarbeit

In: Applied microbiology 23
Seite(n)/Artikel-Nr.: 1 Online-Ressource (XVI, 162 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Biotechnologische Anwendungen sind eine zukunftsweisende Alternative, um die chemische Produktion von Fein- und Massenchemikalien zu ersetzen. Die zirkulare (Bio)Ökonomie zielt darauf ab, fossile Rohstoffe durch nachwachsende Biomasse, CO2 und Kohlenstoffreiche Abfallprodukte zu ersetzen. Dabei werden Wirtsorganismen mit einem erweiterten Substratspektrum verwendet, um dieselben Produkte in einem biologischen System zu produzieren. Die synthetische Biologie wird genutzt, um maßgeschneiderte Überproduktionsstämme für die Anwendungen zu entwickeln. Ein prominenter Vertreter ist Pseudomonas putida KT2440. Ein vielseitiger Stoffwechsel und eine hohe Resistenz gegenüber oxidativem Stress zeichnen diesen Organismus aus. Das Ziel dieser Arbeit war die Anzahl gut charakterisierter und rational konstruierter genetischer Werkzeuge für P. putida KT2440 zu erweitern. Diese Doktorarbeit leistet einen Beitrag dazu, die Zuverlässigkeit in der synthetischen Biologie zu steigern, welche sich häufig als problematisch erweist. Wir haben mehrere Sigma-70-Faktor-abhängige synthetische Promotoren und Kombinationen für die heterologe Genexpression konstruiert und charakterisiert. Eine Promoter-Bibliothek mit einzelnen Basenaustauschen wurde erzeugt, welche zeigte, dass die -35 und -10 Regionen für eine effiziente Promotoraktivität entscheidend sind. Kombinierte Promotoren erlaubten uns, die resultierende Expressionsstärke vorherzusagen, nachdem der genetische Kontext genau charakterisiert wurde. Eine stabile genomische Integration wird häufig für das metabolische Engineering benötigt, es fehlen jedoch charakterisierte Stellen im Genom von P. putida KT2440. Wir haben RNA-Seq-Daten analysiert, um geeignete Integrationsstellen im Genom von P. putida KT2440 zu identifizieren, die gleichmäßig exprimiert werden. Die Charakterisierung der Integrationsstellen zeigte eine hohe Expressionsstärke mit geringer Variabilität, während die Stämme mit verschiedenen Kohlenstoffquellen kultiviert wurden. Die Verwendung von charakterisierten Promoter Sequenzen und Integrationsstellen erlaubt die Genexpression auf zwei Ebenen zu steuern und abzustimmen. Des Weiteren wurden in dieser Doktorarbeit Werkzeuge für das Recycling von Resistenzgenen entwickelt und ein Promoter der von einem alternativen Sigma-Faktor abhängig ist. Zusammenfassend trägt diese Arbeit zur synthetischen Biologie für P. putida KT2440 bei. Die steigende Zahl an verfügbaren und insbesondere charakterisierten Werkzeugen unterstützt die Anstrengungen, P. putida KT2440 als Modelorganismus sowohl in der Bioökonomie als auch in der biotechnologischen Anwendung zu etablieren. Die Verwendung von aromatischen Verbindungen aus Kunststoffen oder Lignin als Substrat stellt eine große Herausforderung dar. Hier kann P. putida KT2440 Vorteile gegenüber anderen etablierten Mikroorganismen nutzen.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Angewandte Mikrobiologie [161710]