Engineering of heme-dependent monooxygenases towards heterocycle conversion

de Almeida Santos, Gustavo; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen (2020, 2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Aromatische sauerstoff- und stickstoffhaltige Heterozyklen (O- und N- Heterozyklen) kommen in der Natur signifikant häufig vor, da sie eine wichtige Klasse bioaktiver Moleküle darstellen und an einer Vielzahl grundlegender biologischer Funktionen beteiligt sind. Benzo-1,4-Dioxan und Indol sind O- bzw. N-Heterozyklen, und ihre regioselektive Hydroxylierung kann kleine bis makrozyklische Bausteine produzieren, die für antimikrobielle, antigrastische, spasmolytische, antipsychotische, anxiolytische und hepatoprotektive Medikamente von großer Bedeutung sind. Darüber hinaus können diese Heterozyklen für die Herstellung von Pestiziden und Farbstoffen verwendet werden. Für die traditionellen chemischen Synthesen dieser Derivate ist jedoch mindestens eine der folgenden Maßnahmen erforderlich: seltener und kostspieliger Katalysator, Erhitzen, aktive Kühlung und Mehrstufenreaktionen. Die Verwendung von P450-Monooxygeanen kann verwendet werden, um diese Heterozyklen auf effizientere und nachhaltigere Weise zu hydroxylieren.Drei verschiedene Monooxygenasen wurden ausgewählt, um die strukturellen Determinanten der Aktivität über die Benzo-1,4-Dioxan- und Indol-Heterozyklen zu untersuchen. Cytochrom P450 BM3 Monooxygenase aus Bacillus megaterium, P450 Cand_1 Monooxygenase aus Pseudomonas sp. 19-rlim und P450 Cand_10 aus Phenylobacterium zucineum. Jedes P450 wurde verschiedenen technischen Strategien unterzogen: P450 BM3 der epPCR, P450 Cand_1 der Sequenz-Sättigungsmethode (SeSaM) und P450 Cand_10 der Site-saturation-mutagenesis (SSM), um ihre Aktivität gegenüber Benzo-1,4-dioxan und/oder Indol zu verbessern. Es wurden produktspezifische Screeningsysteme entwickelt und angewandt, um verbesserte Varianten in allen generierten Bibliotheken effizient zu identifizieren.Signifikant verbesserte Varianten von P450 Cand_10 und P450 Cand_1 wurden nicht gefunden, P450 Cand_1 zeigte eine schlechte und inkonsistente Expression in 2,2 mL Deep-Well-Platten und für P450 Cand_10 sind die Determinanten für die Aktivität über die getesteten Substrate wahrscheinlich außerhalb des aktiven Zentrums, im Tunnelzugang des aktiven Zentrums und/oder in der Proteinhülle vorhanden. Bei P450 BM3 ermöglichten der Phenolnachweis-4-AAP-Assay sowie die entwickelte Multiplex-Kapillarelektrophorese (MP-CE) den gleichzeitigen Nachweis und die Quantifizierung des Zielprodukts und der Nebenprodukte in einem 96-Well-Format. Der Einsatz beider Methoden ermöglichte die Identifizierung der Position R255, die bei Substitution durch Leucin im P450 BM3 WT zu einer ≈140-fachen Erhöhung der anfänglichen Oxidationsrate von Nicotinamid-Adenin-Dinucleotid-Phosphat (NADPH) führt (WT: 8. 3 ± 1,3 min-1; R255L: 1168 ± 163 min-1), ≈21-fachem Anstieg der Gesamtumsatzzahl (TTN) (WT: 40 ± 3; R255L: 860 ± 15) und ≈2.9-fachem Anstieg der Kopplungseffizienz (WT: 8,8 ± 0,1%; R255L: 25,7 ± 1,0%). Eine rechnerische Analyse ergab, dass bei der Substitution von R255 durch Leucin (Substitution entfernt vom Häm-Co-Faktor) die zuvor bestehende Salzbrücke zwischen R255 und D217 (in WT) aufhört zu bestehen, wodurch die I-Helix flexibler wird und das Häm neu angeordnet wird, was eine effizientere Hydroxylierung ermöglicht. Diese Verbesserung beschränkte sich nicht auf die Hydroxylierung von Benzo-1,4-dioxan, und es wurde eine ≈20-fache Verbesserung der Umwandlung der O-Heterozyklen, Phthalan, Isochroman, 2,3-Dihydrobenzofuran, Benzofuran und Dibenzofuran gefunden. Die in der Variante R255L beobachtete Verbesserung bietet nützliche Wege zur selektiven und umweltfreundlichen Herstellung von pharmazeutischen Vorläufersubstanzen durch Hydroxylierung in der Spätphase.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]