How to engineer an organic solvent tolerant lipase: insights from directed evolution and molecular dynamics simulations

Cui, Haiyang; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Elling, Lothar (Thesis advisor)

Aachen (2020)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Kurzfassung

Die Verwendung von Enzymen in organischen Lösungsmitteln (OS) liegt im Interesse von Biotechnologen und Synthesechemikern. Biokatalyse im organischen Lösungsmittel erweitert die synthetischen Anwendungen durch die vielversprechenden Eigenschaften von Lösungsmitteln. Die Instabilität von Enzymen in organischen Lösungsmitteln schränkt jedoch die Erweiterung des enzymologischen Anwendungsbereichs weitgehend ein. In dieser Arbeit wurde die Frage beantwortet, ob man eine lösungsmitteltolerante Bacillus subtilis-Lipase A (BSLA) entwickeln kann, indem Rekombinationsansätze entwickelt werden und die Enzym-Lösungsmittel-Interaktionen auf molekularer Ebene untersucht werden können. Zudem wurden in dieser Arbeit weitere Herausforderungen der gelenkten Evolution und der Molekulardynamik-Simulation (MD) gelöst. Als Beispiele hierfür seien die effizient Rekombination vorteilhafter Substitutionen so wie das Verhalten von Enzymen in Lösungsmitteln. In gelenkten Evolutionskampagnen zeigen systematische Rekombinationsstudien, dass schlecht funktionierende Varianten trotz Rekombination von 3 bis 4 vorteilhaften Substitutionen erhalten werden. Dieses Verhalten schränkt die Forscher darin ein, das Potenzial der Natur zur Erzeugung besserer Enzyme auszunutzen. Die Strategie der computerunterstützten Rekombination (CompassR) bietet eine Auswahlhilfe für vorteilhafte Substitutionen, die rekombiniert werden können, um die Enzymleistung durch Analyse der relativen freien Energie der Faltung schrittweise zu verbessern (ΔΔGfold). Die Leistung der CompassR-Regel wurde durch eine Analyse von 84 Rekombinanten auf 13 Positionen in BSLA bewertet. Darüber hinaus wurden in Kombination mit CompassR zwei effiziente Rekombinationsstrategien vorgestellt, die als 2GenReP (two Gene Recombination Process) und InSiReP (In Silico guided Recombination Process) bezeichnet wurden, um zahlreiche Substitutionen effizient zur Verbesserung der Enzymfunktion zu rekombinieren. 2GenReP- und InSiReP-Strategien wurden durch die Rekombination von 15 isolierten/geclusterten vorteilhaften BSLA Substitutionen validiert. Bemerkenswert war, dass nach dem Screening von ~500 Klonen die "beste" Variante M4 (I12R/Y49R/E65H/N98R/K122E/L124K; in beiden Strategien identifiziert) eine erhöhte Resistenz in 50% (v/v) 1,4-Dioxan (DOX, 14,6-fach), 60% (v/v) Aceton (6,0-fach), 30% (v/v) Ethanol (2,1-fach) und 60% (v/v) Methanol (2,4-fach) im Vergleich zum BSLA-Wildtyp (WT) zeigten. Im Wesentlichen ermöglichen die CompassR-Regel, die 2GenReP- und die InSiReP-Strategie die iterative Rekombination vorteilhafter Substitutionen und helfen den Wissenschaftlern somit bessere Enzyme auf zeiteffiziente Weise zu erzeugen. In MD-Simulationsstudien deuten die erhaltenen Forschungsergebnisse über die Wechselwirkung von Lösungsmitteln und Enzymen darauf hin, dass weitere Studien zur vollständigen Interpretation der Rolle von Lösungsmittel-Enzym-Wechselwirkung erforderlich sind. Ein umfassendes Verständnis solcher Wechselwirkungen ist für Biotechnologen besonders wichtig, um Lösungsmittelresistente Enzyme zu entwerfen. Die MD-Simulationen von BSLA-WT und BSLA-Substitutionen wurde jeweils in verschiedenen Lösungsmitteln durchgeführt. In Bezug auf BSLA WT zeigten die MD-Simulationen, dass drei Lösungsmittel (DOX, Dimethylsulfoxid (DMSO), 2,2,2-Trifluorethanol (TFE)) die BSLA-Aktivität und -Resistenz in Lösungsmitteln reduzieren, indem sie (i) essentielle Wassermoleküle von der BLSA-Oberfläche hauptsächlich durch Ausbildung von intermolekularen Wasserstoffbrückenbindungen minimieren; und (ii) in den Substratbindungsspalt eindringen, was Inhibition verursacht und Konformationsänderungen verursacht. Interessanterweise zeigten computer-gestützte Untersuchungen der "BSLA-SSM"-Variantenbibliothek (3439 Varianten; natürliche Diversität mit je 19 Aminosäurenaustauschen pro Position) zwei komplementäre rationale Designstrategien: (i) Oberflächenladungs-Engineering und (ii) nichtpolares Substratbindungsspalt-Engineering. Im Falle der BSLA-Substitutionen wurden 20 Einzelsubstitutionen (zehn vorteilhafte und zehn nicht vorteilhafte) für die Lösungsmittelresistenzstudie in TFE ausgewählt. Nach der Analyse von 35 möglichen Faktoren in Bezug auf Struktur, Solvatisierung und Interaktionsenergie auf Molekülebene wird festgestellt, dass eine erhöhte Hydratation der substituierten Stelle der vorherrschende Faktor für die verbesserte Resistenz in organischen Lösungsmitteln ist. Während der iterativen Rekombination von vier vorteilhaften Substitutionen korreliert der molekulare Hydratationsgrad der BSLA-Variante positiv mit ihrem Lösungsmittel-Widerstand (R2=0,91), was zu einer superstabilen BSLA-Variante (I12R/M137H/N166E) zu einer 7,8-fach verbesserten Lösungsmittelresistenz in 12% (v/v) TFE führt. Die Berücksichtigung der Faktoren der Enzymhydratation sowie der Oberflächentechnik kann eine effektivere und effizientere Strategie bei der rationalen Anpassung der Enzymstabilität in organischen Lösungsmitteln anleiten. Insgesamt haben die untersuchten Rekombinationsansätze (d.h. CompassR, 2GenReP und InSiReP) und die rationalen Designstrategien (d.h. Oberflächenladungs- und nichtpolare Substratbindungs-Spalttechnik), die sich aus dem molekularen Verständnis der Enzym-Lösungsmittel-Interaktion (d.h. Wasserstoffbrückenbindungen, Hydratationseffekt) ergeben, Wissenschaftlern ermöglicht, eine bessere lösungsmitteltolerante Lipase zu entwickeln. Außerdem ist es sehr wahrscheinlich, dass alle entdeckten Designprinzipien auf andere Enzyme mit einer ähnlichen α/β-Hydrolase-Faltung übertragen werden können, was einen beeindruckenden Fortschritt auf dem Gebiet der Biokatalyse in OS darstellt.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]