Role and regulation of the metalloproteinase ADAM8 in liver inflammation and hepatocellular carcinoma

Awan, Tanzeela; Ludwig, Andreas (Thesis advisor); Pradel, Gabriele (Thesis advisor); Zenke, Martin (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Die Leber ist der Hauptort der Metabolisierung von Lipiden, Proteinen und Kohlenhydraten. Aus dem Darm stammende Abbauprodukte wie Lipopolysaccharid (LPS) oder Toxine können eine Immunantwort in der Leber hervorrufen, welche zu einer Leberentzündung führen kann. Zudem kann LPS die Entwicklung chronischer Leberschäden beeinflussen, welche bei Erkrankungen wie der Virushepatitis, der alkoholischen Lebererkrankungen und der nicht alkoholischen Fettlebererkrankungen (NAFLD) zu beobachten sind. NAFLD umfasst ein Spektrum von Krankheiten, das von einer einfachen Steatose ausgehend zu einer nichtalkoholischen Steatohepatitis, einer fortschreitenden Zirrhose und schließlich einem hepatozellulären Karzinom(HCC) reicht. In den letzten Jahrzehnten wurden Mitglieder der A Disintegrin And Metalloproteinase (ADAM)-Familie ausführlich hinsichtlich ihrer Rolle bei der Entwicklung von Inflammation und Krebs untersucht. ADAM8 als Mitglied der ADAM-Familie beeinflusst nicht nur durch seine katalytische Aktivität Prozesse der Entzündung und Metastasierung, sondern auch durch seine Wechselwirkung mit anderen Zelloberflächenproteinen. Die vorliegende Studie zielte darauf ab, den Einfluss von ADAM8 in der Leberentzündung und dem Leberkarzinom zu untersuchen. In murinen Entzündungsmodellen wie NAFLD, der LPS-induzierten Entzündung, der Gallengangsligatur (BDL) und der partiellen Hepatektomie stieg die mRNAExpression von ADAM8 im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren an. Die verstärkte mRNA-Expression von ADAM8 in den getesteten Mausmodellen ging mit einer erhöhten mRNA-Expression von Tumornekrosefaktor (TNF) α und Interleukin (IL)-6 einher. Parallel dazu wurde die Regulation der ADAM8-Expression in vitro durch Verwendung verschiedener kultivierter Leberzelltypen untersucht. Eine starke Induktion der ADAM8-Expression unter NALFD-Bedingungen konnte auf transkriptioneller und translationaler Ebene in Zelllinien humaner und muriner Hepatozyten (Hepatom-Zelllinien; HepG2 & Hepa1-6), in humanen und murinen Endothelzelllinien und hepatischen Sternzellen, als auch in primären murinen Hepatozyten nachgewiesen werden. Eine Herabregulation der ADAM8-Expression in murinen Zellen durch small interfering RNA (siRNA) und in humanen Zellen durch short hairpin RNA (shRNA) zeigte, dass die Induktion von freigesetztem TNFα, IL-6, IL-8 / keratinocytes-derived chemokine (KC) und CX3CL1 in fast allen Zelltypen positiv mit der ADAM8-Expression assoziiert ist. Darüber hinaus reduzierte der ADAM8-Knockdown die mRNA-Expression von α smooth muscle actin (αSMA) in Lebersternzellen. Die Rolle von ADAM8 in der durch LPS induzierten entzündlichen Reaktion wurde unter Verwendung von primären Hepatozyten und eines murinen in vivo Modells untersucht. Primäre murine Hepatozyten aus gesunden Kontroll- (WT) und ADAM8-KO-Mäusen wurden präpariert und in vitro mit LPS behandelt. Die LPS-Behandlung führte zu einem Anstieg der ADAM8-Expression in den primären Hepatozyten der Kontrolltiere, ein Effekt, der auch in Hepatozyten- und Endothelzelllinien beobachtet wurde. Gleichzeitig stiegt sowohl die Expression als auch die Freisetzung von TNFα und IL-6. Dieser Effekt wurde durch den Knockdown bzw. Knockout von ADAM8 verringert. Für in vivo-Untersuchungen wurden gesunde Kontroll-(WT) und ADAM8-KO-Mäuse entweder mit Kochsalzlösung oder LPS behandelt, um eine akute Leberentzündung zu induzieren. In Kontrolltieren führte die LPS-Behandlung zu einem Anstieg der mRNA-Expression von ADAM8, TNFα und IL-6. Der ADAM8-KO schien nur die Expression von IL-6 zu reduzieren, was jedoch aufgrund der hohen Variabilität unter den Tieren keine statistische Signifikanz erreichte. Die Freisetzung von TNFα und IL-6, sowie die Leberenzymwerte wurden durch die LPS-Behandlung nicht stark induziert. Dies kann dadurch erklärt werden, dass es sich hier nur um eine leichte Entzündung in der Leber handelte, welche die mRNA-Expression von Zytokinen nur geringfügig erhöhte. Die Expression von ADAM8 ist auch bei verschiedenen Krebsarten stark induziertun korreliert häufig mit einer schlechten Prognose. In der vorliegenden Studie wurde festgestellt, dass die ADAM8-Expression in HCC-Lebergeweben erhöht ist. Der Vergleich der ADAM8-Expression in Hepatozyten-Zelllinien (Hepatom-Zelllinien; HepG2 & Hepa1-6) und primären Hepatozyten zeigte, dass ADAM8 in HepatomZelllinien auf einem viel höheren Niveau exprimiert wird. Die Herabregulation von ADAM8 in Hepatom-Zelllinien verringerte die Zellproliferation, die Zellmigration und die Zellinvasion, während die ADAM8-Überexpression all diese zellulären Aktivitäten erhöhte. Auch Endothelzellen zeigten eine verminderte Zellproliferation, Migration und Invasion bei ADAM8-Knockdown. Zusätzlich war die Fähigkeit zur Bildung von Tubuli in Endothelzellen nach ADAM8-Knockdown verringert. Die Herabregulation von ADAM8 in Hepatomzellen führte zu einer starken Induktion von Apoptose, welche durch die Überexpression der Protease reduziert wurde. Darüber hinaus wurde eine positive Beziehung von ADAM8 zur β1-Integrin-Expression und zur Aktivierung von nachgeschalteten Signalmolekülen einschließlich focal adhesion kinase (FAK), SrcKinase, mitogen-activated protein kinase (MAPK) und Rho-GTPase unter Verwendung von Hepatomzelllinien nachgewiesen. Diese Ergebnisse belegen eine entscheidende Rolle von ADAM8 bei der Regulation der Metastasierung durch die Aktivierung der β1-Integrin-FAK-Rho-Achse in HCC-Zellen. Zudem fördert ADAM8 die Angiogenese. Damit stellt ADAM8 ein Zielmolekül dar, über welches nicht nur die Metastasierung und Proliferation, sondern auch die Angiogenese bei HCC therapeutisch beeinflusst werden könnte.

Einrichtungen

• Lehr- und Forschungsgebiet Zelluläre und Angewandte Infektionsbiologie [164020]
• Fachgruppe Biologie [160000]
• [528500-2]