Rational and model-based characterization of heterologous gene expression in biological systems

• Rationale und modellbasierte Charakterisierung von heterologer Genexpression in biologischen Systemen

Gengenbach, Benjamin Bruno; Buyel, Johannes Felix (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Die Produktion von rekombinanten Proteinen für human- und veterinärmedizinische Anwendungen bildet einen stark wachsenden Wirtschaftssektor, mit großem Bedarf für Antikörper, Impfstoffe, Enzyme und Hormone. Pflanzen bieten sich neben etablierten tierischen und mikrobiellen Systemen als kosteneffiziente und einfach skalierbare Produktionsplattform an, die in der Lage ist komplexe Glycoproteine und sogar Peptide, die für tierische Zelllinien toxische sind, zu produzieren. Während mikrobielle und tierische Screening-Plattformen für die automatisierte, hochdurchsatzfähige Identifikation von Kandidaten für die Großproduktion vorhanden sind, stellt dies bei pflanzlichen Systemen eine Lücke und relevante Eintrittsschwelle in den Markt dar. Ziel dieser Arbeit war es eine automatisierte Hoch-Durchsatz Screening-Plattform für die transiente Proteinexpression in Pflanzen zu entwickeln und so die Möglichkeit zu eröffnen pflanzenbasierte Produktionssysteme auf ein vergleichbares Niveau zu den etablierten Goldstandards der biopharmazeutischen Wirkstoffproduktion zu heben. Hierfür wurde die Plant Cell Pack (PCP) Technologie, die als Modellsystem zur Vorhersage von Expressions- und Aufreinigungsparametern in ganzen Pflanzen dienen kann, mittels statistischer Versuchsplanung für den Einsatz auf einer automatisierten Laborplattform weiterentwickelt. Geeignete Methoden zur Herstellung und Inkubation von miniaturisierten N. tabacum BY-2 PCPs wurden identifiziert und das System so in ein automations-kompatibles 96-well Standard-Plattenformat überführt. Im Anschluss wurde ein vollautomatisiertes Protokoll etabliert, das die Herstellung, Infiltration und Extraktion von bis zu 4.800 PCPs pro Tag ermöglicht und zur weiteren Optimierung mit statistischen Versuchsplänen kompatibel ist. Menschliche Eingriffe wurden auf ein Mindestmaß reduziert was eine gleichbleibende und zuverlässige Durchführung von Screeningläufen erlaubt, während die Kosten im Vergleich zur manuellen Herstellung von 0,50 € auf 0,23 € pro PCP gesenkt wurden. Weiter wurde eine Qualitätsroutine das BY-2 Zellmaterial betreffend implementiert, wodurch die Vergleichbarkeit zwischen Läufen sowie eine definiert niedrige Varianz von < 10% CV innerhalb jeder Messung sichergestellt, und potentiell kompromittierte Läufe unmittelbar aussortiert werden. Zusätzlich wurde ein optimiertes Infiltrationsprotokoll für ganze Pflanzen entwickelt, wodurch Produktkonzentrationen im Vergleich zu dem Referenzprotokoll um 20-40 % erhöht wurden. Final wurden Korrelationsfaktoren zwischen dem automatisierten PCP System und ganzen Pflanzen bestimmt, wobei eine lineare Korrelation der DsRed Expression mit einem angepassten r2 von 0.96 über vier Zelllkompartimente von N. tabacum erzielt wurde.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Molekulare Biotechnologie [162910]