Directed evolution of polymerases and its application in sequence saturation mutagenesis

Chung, Mu-En; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Elling, Lothar (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Die gerichtete Evolution spielt eine entscheidende Rolle bei der Weiterentwicklung moderner biotechnologischer, medizinischer und industrieller Technologien. Die Bedeutung der gerichteten Evolution wurde kürzlich durch den Nobel Prize in Chemie im Jahr 2018 gewürdigt. Sie besteht aus iterativen Schritten der Diversitätserzeugung und Isolierung der Varianten mit verbesserten Proteineigenschaften. Jede Evolutionsrunde kann als ein Schritt auf dem Weg zum "Hügel der gewünschten Eigenschaft" im Proteinsequenzraum angesehen werden. Da der Sequenzraum eines Proteins normaler Größe den Durchsatz bestehender Screening-Methoden bereits bei weitem übersteigt, ist eine Gendiversifikationsmethode, die eine vielfältige und unverzerrte Mutanten-Bibliothek generiert, entscheidend für einen effizienten Weg zum "Hügel" mit minimaler Anzahl von Schritten. Es wurde berichtet, dass die Sequenzsättigungsmutagenese (SeSaM) ein ausgeprägtes Mutationsspektrum generiert, das durch epPCR, welche eine der am weitesten verbreiteten Methoden für Zufallsmutagenese darstellt, nicht erzeugt werden kann. Sowohl SeSaM als auch epPCR erzeugen jedoch selten aufeinanderfolgende Transversionen (TvTv). TvTv-Mutationen sind besonders wichtig für die Generierung von Enzymbibliotheken mit diversen Aminosäuresubstitutionen und breiter chemischer Vielfalt. 91,4 % der durch TvTv-Mutationen erzeugten Aminosäuresubstitutionen sind verschieden und 90 % davon sind chemisch unterschiedlich. Die Herausforderung bei der Generierung von TvTv-Mutationen liegt in der Struktur der DNA, in der Transversionsmutationen sperrige oder wackelige Fehlpaarungen bilden, die die Doppelhelixbildung destabilisieren und für DNA-Polymerasen im Vergleich zu Transitions-Mutationen strukturell ungünstig sind. Im ersten Teil der Dissertation entwickelten wir SeSaM-DV, eine fortschrittliche SeSaM-Methode, die eine neue Mismatch-tolerante Polymerase einsetzt und die höchste jemals berichtete Menge an TvTv-Mutationen erzeugte (217 % der besten berichteten Zahl). Bei der Entwicklung von SeSaM-DV wurde ein DNA-Polymerase-Assay entwickelt, der die Fähigkeit zur Toleranz von Fehlpaarungen herausstellt. Anschließend wurden dreizehn DNA-Polymerasen auf ihre Fähigkeit untersucht, über aufeinanderfolgende phosphorthioierte Fehlpaarungen hinweg zu lesen, was als "Flaschenhals" für die Erhöhung aufeinanderfolgender Substitutionen in SeSaM-Bibliotheken gilt. Die Verwendung des Polymerase-Mismatch-Toleranz-Assays S. islandicus DNA-Polymerase IV (Sis. Dpo4) zeigte die beste Fähigkeit, aufeinanderfolgende Fehlpaarungen zu verlängern, und wurde daher in einem zusätzlichen PCR-basierten Assay eingesetzt, der die Fähigkeit von Sis. Dpo4 direkt validierte, um vier Arten von aufeinanderfolgenden Fehlpaarungen zu erweitern und damit TvTv-, TvTs-, TsTv- und TsTs-Substitutionen zu erzeugen. Schließlich wurde Sis. Dpo4 in SeSaM Schritt 3 unter Zugabe von Vent exo- integriert, um eine effiziente Extension nach dem Lesen über Fehlpaarungen zu erreichen. Die resultierende SeSaM-DV-Bibliothek wurde durch Sequenzierung einem Benchmarking unterzogen und 10% der identifizierten Mutationen waren TvTv-Mutationen, was 2,17-mal besser ist als die beste, in der Literatur beschriebene Zahl. Mit der neuen Art von TvTv-angereichertem Mutationsbias können Enzyme durch SeSaM-DV effizient entwickelt werden, indem der Sequenzraum der Natur auf eine neue "nicht-natürliche" Weise mit einer chemischen Vielfalt erweitert wird, was ein besserer Ansatz zur Entwicklung von Enzymen für industrielle Produktionen sein könnte, die oft nicht-natürliche Bedingungen wie organische Lösungsmittel und stark veränderte pH-Werte benötigen. Microbial Cell Surface Display (CSD) ist eine leistungsstarke Plattform, um ein Protein von Interesse auf mikrobiellen Oberflächen zu präsentieren und zu immobilisieren. CSD bietet eine Genotyp-Phänotyp-Verknüpfung ohne die Notwendigkeit einer künstlichen Kompartimentierung des Proteins. Sein kodierendes Gen ermöglicht somit ein FACS-basiertes Ultrahochdurchsatz-Screening von Proteinbibliotheken. Bislang wurden verschiedene Proteine auf mikrobiellen Oberflächen präsentiert, jedoch wurde dies nach unserem besten Wissen bisher noch nicht für eine Nukleinsäure (NA)-Polymerase erfolgreich durchgeführt. Im zweiten Teil der Dissertation entwickelten wir ein funktionelles Zelloberflächendisplay für eine Nukleinsäurepolymerase (das erste seiner Art) und führten eine gerichtete Evolution durch, um 2’-O-Methylnukleotidtriphosphate (2’-OMe-NTPs) effizient einzubauen. Bei der Entwicklung des Polymerase-Zelloberflächen-Displays wurden zwei Autotransporterproteine (Escherichia coli Adhesin, welches in diffuser Adhäsion involviert ist, und Pseudomonas aeruginosa Esterase A, EstA) verwendet, um das 68 kDa Klenow-Fragment der E. coli DNA Polymerase I (KF) auf der Oberfläche von E. coli zu verankern. Die Lokalisation und Funktion des präsentierten KF wurden durch Analyse der Zellaußenmembranfraktionen, Immunfärbung und durch einen fluorometrischer Nachweis synthetisierter DNA-Produkte verifiziert. Das EstA-Zelloberflächen-Display-System wurde verwendet, um KF für den Einbau von 2’-OMe-NTPs zu entwickeln, und es wurde eine KF-Variante mit einer 50,7-fach erhöhten Fähigkeit zum sukzessiven Einbau von 2’-OMe-NTPs entdeckt. Die Erweiterung des Portfolios von Proteinen, die auf der Zelloberfläche dargestellt werden können, durch Polymerasen, bietet ein neuartiges Screening-Tool zur Anpassung von Polymerasen an verschiedene Anforderungen an PCR- und sequenzierungsbasierten biotechnologischen und medizinischen Anwendungen. Insbesondere ermöglicht das Zelloberflächen-Display neuartige Polymerase-Screening-Strategien, bei denen der Hitze-Lyse-Schritt umgangen wird und somit das Screening von mesophilen Polymerasen mit einem breiten Anwendungspotential ermöglicht wird, das von der Diagnostik und DNA-Sequenzierung bis hin zur Replikation synthetischer, genetischer Polymere reicht.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]