Engineering of prodigiosin ligase pigC towards production of short-chain prodiginines

Brands, Stefanie; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Jaeger, Karl-Erich (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Die Prodigiosinsynthetase PigC ist eine ATP-abhängige membranassoziierte Ligase, die den letzten Reaktionsschritt in der Biosynthese von Prodigiosin in Serratia marcescens katalysiert. Zwei Pyrrol-Vorläufermoleküle, 4-Methoxy-2,2’-bipyrrol-5-carbaldehyd (MBC) und 2-Methyl-3-amyl-pyrrol (MAP) werden kondensiert, um das tiefrote tripyrrolische Pigment Prodigiosin bereitzustellen. Als Sekundärmetabolite bieten Prodiginine ein breites Spektrum an Bioaktivitäten (z. B. als Antibiotika, Antimykotika, Nematizide, potentielle Malaria- sowie Krebstherapeutika), die bereits das Interesse von Agrar-, Pharma- und Lebensmittelindustrien geweckt haben. Interessanterweise modulieren die Seitenketten, die die tripyrrolische Prodigininstruktur dekorieren, die Bioaktivitäten von Prodigininen. Beispielsweise ist die Antikrebswirkung bei Prodigininen mit kurzen aliphatischen Seitenketten besonders ausgeprägt. Pyrrole mit kurzen Seitenketten werden jedoch von Prodiginin-Ligasen, deren Aktivität in der biokatalytischen Prodiginin-Produktion limitierend ist, wenig umgesetzt. In dieser Arbeit wurde durch Protein-Engineering der Prodigiosin-Ligase PigC die Akzeptanz kurzkettiger Pyrrole optimiert. Darüber hinaus wurde ein erstes molekulares Verständnis der Substrattranslokation und Substratbindung in PigC generiert. Mutagenesebibliotheken von pigC wurden heterolog im Prodiginin-resistenten Stamm Pseudomonas putida KT2440 exprimiert. Die Etablierung eines Hochdurchsatz-Screeningsystems mit einer niedrigen Produktnachweisgrenze (0,5 µM), einem breiten linearen Bereich (0,5-250 µM) und einer niedrigen Standardabweichung <15% für verschiedene Pyrrolsubstrate ermöglichte die Durchführung der ersten gerichteten Evolutionskampagne von PigC. Im Zuge einer KnowVolution-Runde wurde die katalytische Effizienz von PigC mit kurzkettigen Substraten in der finalen Variante S1 um das fast 40-Fache erhöht (I365G/M671V; kcat = 7,5 min- 1; kcat/KM = 23,9 mM-1 s-1 im Vergleich zum PigC-Wildtyp mit kcat = 0,7 min 1; kcat/KM = 0,6 mM 1 s-1). Im konsekutiven semi-rationalen Ansatz wurden die Substrat-Bindetasche sowie Zugangstunnel von PigC durch ortspezifische Sättigungsmutagenese ausgewählter semi-konservierter Aminosäurereste optimiert. Drei vorteilhafte Aminosäure-Substitutionen (V333A, T334A und R674Q) ermöglichten i) eine bevorzugte Docking-Position des Liganden mehr als 3 Å näher am aktiven Zentrum H840 (3,5 statt 6,9 Å) und ii) die Vergrößerung des Zugangstunnel-Querschnitts um 4 Å2, was einen effizienteren Ligandentransport ermöglichte. Die katalytische Aktivität von PigC erhöhte sich nach Rekombination der vorteilhaften Substitutionen T334A/R674Q um fast das 3,5-Fache (kcat = 0,9 bis 3,1 min-1). Schließlich wurde die Prodigiosinligase PigC in dieser Arbeit, unter Generierung von molekularem Verständnis, sowohl durch gerichtete Evolution als auch durch semi-rationales Design erfolgreich optimiert. Basierend auf den Erkenntnissen dieser Arbeit kann somit in Zukunft eine neue biokatalytische Syntheseroute etabliert werden, die kurzkettige Prodiginine mit verbesserter Bioaktivität bereitstellt.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]