Phytase engineering for efficient phosphate recovery from press cakes

• Phytase-Engineering zur effizienten Phosphatrückgewinnung aus Presskuchen

Herrmann, Kevin Rico; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Blank, Lars M. (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Phosphor (P) ist eines der essentiellsten Elemente und spielt als Schlüsselnährstoff in Düngemitteln eine zentrale Rolle bei der Ernährung der Menschheit. Durch höhere Konsum- als Regenerationsraten, bedenkliche Abbaubedingungen und den Übergang zu einer erneuerbaren Bioökonomie werden starke soziale Impulse zur Entwicklung von Strategien zur P-Rückgewinnung geschaffen. Hauptziel dieser Arbeit ist die effiziente Phosphat-Rückgewinnung aus entölten Samen und Nüssen unter Verwendung von Phytase-Enzymen zur Valorisierung pflanzlicher Nebenprodukte. Die Quantifizierung der Phosphorspeicherform Phytat (InsP6) in weltweit verbreiteten Presskuchen ergab Phytatgehalte > 3 % (w/w), was das verborgene Potenzial für die P-Rückgewinnung aufzeigt. Die Entwicklung eines breit anwendbaren und nachhaltigen Phosphat-Rückgewinnungsverfahrens aus pflanzlicher Biomasse unter Verwendung von Phytasen erwies sich als sehr effizient bei der Rückgewinnung hoher Phosphatmengen. Die auf Phytasen basierende Hydrolyse von InsP6 in wässriger Suspension bei moderaten Temperaturen setzt Phosphatmengen > 20 mg/g Presskuchen frei und ist auf mehr als 20 Presskuchen anwendbar. Die weltweite industrielle Anwendung könnte signifikante Mengen von bis zu 1 Million Tonnen liefern, wobei das zurückgewonnene Phosphat zur Herstellung hochwertiger P-basierter Produkte wie grünem Dünger oder Polyphosphat als Lebensmittelkonservierungsmittel verwendet werden könnte, die eine zirkuläre Bioökonomie für P ermöglichen. Ein Flaschenhals für die vollständige Phytat-Hydrolyse durch Phytase-Enzyme ist der im Vergleich zu InsP6 drastisch verringerte Abbau von weniger phosphorylierten Reaktionszwischenprodukten ab InsP4. Phytat besitzt sechs Phosphatgruppen, die unter normalen Reaktionsbedingungen negativ geladen sind, und die Nettoladung wird während der Hydrolyse zu niedrigeren InsPs drastisch reduziert. Daher ist aus Sicht vom Protein Engineering die Fähigkeit, alle sechs Phosphatgruppen zu hydrolysieren, für ein Enzym eine große Herausforderung, da es mit diesen erheblichen Veränderungen fertig werden muss. In der hier vorliegenden Arbeit wird die erste Evolutionskampagne der E. coli Phytase für eine verbesserte Hydrolyse von InsP4 und InsP3 durchgeführt. Nach der Implementierung eines geeigneten Screening-Systems und der Isolierung der erforderlichen Substrate führte die auf KnowVolution basierende Evolution zu Varianten mit einer bis zu 3,8-fach verbesserten Hydrolyse von InsP4, während die Hydrolyse von InsP3 um bis zu 2,7-fach gesteigert wurde. Vorteilhafte Substitutionen befinden sich innerhalb der Bindungstasche und sind an der Substratbindung und -orientierung beteiligt. Darüber hinaus gibt es einen Bedarf an maßgeschneiderten Phytasen in einer Vielzahl von Bereichen wie Lebensmitteln, Futtermitteln oder technischen Anwendungen. Durch DNA-Rekombination von entfernt verwandten Genen können Chimären erzeugt werden, die vorteilhafte Eigenschaften der elterlichen Enzyme in einem Protein vereinen. Eine PTRec-basierte DNA-Rekombinationsbibliothek auf der Grundlage einer ausgefeilten rechnergestützten Analyse zeigte das Potenzial für eine effiziente Rekombination von sechs Genen mit niedrigen Sequenzidentitäten von < 50 %, um hochfunktionelle Chimären zu generieren. Zwei Phytasechimären mit bis zu 32 % verbesserter Restaktivität (90 °C, 60 min) und gleichbleibend hohen spezifischen Aktivitäten von > 1100 U/mg wurden identifiziert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das P-Recycling ein wichtiger Aspekt für eine zirkuläre Bioökonomie ist und ein Baustein das hier vorgestellte phytasebasierte Verfahren zur Anwendung auf Biomasse sein kann. Protein Engineering bietet eine Vielzahl von Methoden, um Phytasen weiter maßzuschneidern und damit P-Rückgewinnungsprozesse wirtschaftlicher zu gestalten.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]