Studies of the cytokine-induced regulation and the biological functions of Lipocalin-2 in human prostate cancer cell lines

• Untersuchungen zur zytokin-induzierten Regulierung und den biologischen Funktionen von Lipocalin-2 in humanen Prostatakrebs-Zelllinien

Schröder, Sarah Katharina; Pradel, Gabriele (Thesis advisor); Weiskirchen, Ralf (Thesis advisor); Müller, Frank (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Prostatakrebs (PCa) ist eine der häufigsten und tödlichsten Krebserkrankungen bei Männern weltweit. Ein wichtiger Faktor für die Initiation und Progression des Prostatakarzinoms ist eine proinflammatorische Tumormikroumgebung (engl. TME). Der Tumor und die umgebenden Zellen sezernieren verschiedene Zytokine und andere lösliche Mediatoren, die die Tumorgenese beeinflussen. Ein löslicher Mediator ist das sekretierte Transportprotein Lipocalin-2 (LCN2). Bei PCa-Patienten wurde ein erhöhtes LCN2 Level gefunden und eine Korrelation mit ungünstigen klinisch-pathologischen Merkmalen beschrieben. Außerdem ist bekannt, dass LCN2 bei anderen Krebsarten verschiedene Stadien der Tumorentwicklung beeinflusst. Dennoch sind die genauen Mechanismen der LCN2-Regulation und seine genaue Rolle in der PCa Onkogenese noch wenig verstanden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, zu untersuchen, ob LCN2 durch proinflammatorische Zytokine im PCa reguliert wird, um mögliche neue Zielstrukturen für die Therapie zu identifizieren. Zunächst wurde die LCN2-Expression in den humanen metastasierenden PCa-Zelllinien LNCaP und PC-3 mittels RT-qPCR und Western-Blot-Analysen untersucht. Es zeigte sich, dass PC-3 Zellen große Mengen an LCN2 exprimieren und sezernieren, während LNCaP Zellen eine deutlich geringere LCN2-Expression aufweisen. Die Zelllinien wurden mit proinflammatorischen Zytokinen stimuliert, um die LCN2-Induktion zu untersuchen und aktivierte Signalwege zu entschlüsseln. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass LCN2 mRNA und seine Proteinexpression durch TNF-α in den stark-metastasierenden PC-3 Zellen stark induzierbar ist, aber die Expression in den LNCaP dadurch unverändert bleibt. Im Gegensatz dazu erhöhte die Stimulation mit IL-1β das LCN2-Level nur in den LNCaP Zellen signifikant. Die Signalwege p38, NF-κB und JNK wurden kurz nach der Zytokin-Behandlung in beiden Zelllinien aktiviert. Spezifische pharmakologische Inhibitoren zeigten, dass die NF κB und JNK Signalwege für die TNF-α-vermittelte LCN2-Induktion in den PC-3 Zellen verantwortlich ist. Auf der anderen Seite wurde gefunden, dass in den LNCaP Zellen die IL 1β induzierte Hochregulierung von LCN2 durch NF-κB-Aktivierung und IκBζ Stabilisierung vermittelt wird. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Funktion von LCN2 im metastasierenden PCa untersucht. Zu diesem Zweck wurde LCN2 in den PC-3 Zellen transient mittels siRNA oder stabil über einen CRISPR/Cas9-vermitteltem Knockout runterreguliert. Der Knockdown von LCN2 führte zu einer deutlichen Abnahme von IL-1β. Interessanterweise wiesen verschiedene stabile, aus Einzelzellen abgeleitete LCN2-Knockout (KO)-Zelllinien eine generelle Reduktion der Zytokin-Expression auf. Umgekehrt stellte die Re-Expression oder Supplementierung von LCN2 die IL-1β-Expression in diesen Zellen wieder her. Darüber hinaus zeigten LCN2-defiziente Zellen weitere Charakteristika wie eine reduzierte Proliferation und Adhäsion sowie eine erhöhte Antwort auf ungefaltete Proteine (engl. Unfolded Protein Response, UPR). Verschiedene UPR-Marker wurden in PC-3 und LCN2-KO Zellen durch die Behandlung mit Tunicamycin aktiviert. LCN2-KO Zellen zeigten jedoch eine erhöhte und dauerhafte UPR, da sie im Vergleich zu den parenteralen PC-3 Zellen höhere Spiegel von p-NF κB und p-EIF2α aufwiesen. Insgesamt wurden in der vorliegenden Arbeit neue Erkenntnisse über das Zusammenspiel von Zytokinen und LCN2 im PCa gewonnen. Die Daten weisen darauf hin, dass neben NF κB der JNK-Signalweg ein zusätzlicher Angriffspunkt für Therapieansätze beim PCa ist. Die Ergebnisse der generierten LCN2-defizienten Zellen weisen auf verschiedene Funktionen von LCN2 in der PCa Onkogenese hin, darunter eine Rolle bei Entzündung, Adhäsion und UPR. Darüber hinaus wurde IL-1β als ein neuartiges downstream Target von LCN2 in PC-3 Zellen identifiziert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit tragen zum Verständnis der Regulation und Rolle von LCN2 in vitro bei und ebnen den Weg für die Entwicklung von Tiermodellen zur Untersuchung der Tumorgenese von PCa in vivo.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehr- und Forschungsgebiet Zelluläre und Angewandte Infektionsbiologie [164020]
• [525500-2]