Cellulase protein engineering towards improved thermostability

Contreras Leiva, Francisca; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Elling, Lothar (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021, 2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Lignozellulose-Biomasse ist ein vielversprechender, reichlich vorhandener und preiswerter Rohstoff, der in verschiedenen Industriezweigen wie der Produktion von Zellstoff und Papier, Textilien, Lebensmitteln, Futtermitteln und Biokraftstoffen eingesetzt werden kann. Lignozellulose-Biomasse ist ein komplexes Polymer, das aus miteinander verflochtener Zellulose, Hemizellulose und Lignin besteht, wobei Zellulose den Hauptbestandteil darstellt. Zellulose ist ein kristallines, unverzweigtes Polymer, das aus Glukosemonomeren besteht. Die Fasern der Zellulose interagieren miteinander und bilden ein äußerst widerstandsfähiges Material, was seinen Abbau erschwert (z. B. sind hohe Temperaturen und Druck erforderlich). Aufgrund der Komplexität von Cellulose erfolgt der biologische Abbau von Cellulose durch die gemeinsame Wirkung verschiedener Cellulasen: Cellobiohydrolasen, Endo-β-1,4-Glucanasen und β-Glucosidasen. Der Einsatz von Cellulasen als industrielle Biokatalysatoren hängt von ihrer Fähigkeit ab, den harschen Bedingungen zu widerstehen, die für den Abbau von lignozellulosehaltiger Biomasse herrschen. Thermostabile Cellulasen ermöglichen kosteneffizientere und nachhaltigere Prozesse, da sie zum verringerten Einsatz von umweltschädlichen Chemikalien beitragen können, die heute für den Celluloseabbau verwendet werden, und stellen somit einen alternativen grünen Katalysator, beispielsweise für die Herstellung von Biokraftstoffen, dar. Daher ist das Verständnis der Thermostabilität von Cellulasen für ihre Anwendung beim Abbau von Lignocellulose-Biomasse von großer Bedeutung. In den letzten Jahrzehnten hat sich das Protein-Engineering zu einer leistungsfähigen Technologie entwickelt, die zum Verständnis verschiedener Proteineigenschaften wie der Thermostabilität beiträgt. Das Hauptziel dieser Doktorarbeit war es, das Wissen über die Strukturelemente zu erweitern, die die Thermostabilität von Endoglucanasen aus der Glycosylhydrolase-Familie 5 bestimmen, und herauszufinden, wie diese Elemente für einen effizienteren Abbau von Lignozellulose-Biomasse effizient gestaltet werden können. Dementsprechend wurde die Endo-β-1,4-Glucanase Cel5A aus Penicillium verruculosum auf eine verbesserte Thermostabilität hin entwickelt. In dieser Studie wurde ein robustes Hochdurchsatzsystem für die Auswahl von thermostabilen Endoglucanasen etabliert und validiert. Darauf aufbauend wurde eine KnowVolution-Protein-Engineering-Kampagne durchgeführt, und der C-Terminus wurde als kritische Strukturdeterminante identifiziert, die die Thermostabilität von Cel5A verbessert, ohne die Aktivität zu beeinträchtigen. Die molekularen Gründe für die Thermostabilität von Cel5A, die durch den C-Terminus bestimmt werden, wurden untersucht. Der Einfluss des C-Terminus auf die Thermostabilität und Aktivität von Cel5A wurde durch gezielte Mutagenese weiter untersucht. Schließlich wurde die Effizienz der Constraint Network Analysis als in silico Werkzeug zur Bestimmung von Positionen mit verbesserter Thermostabilität in Cel5A analysiert. Als zentrales Ergebnis wurde der C-Terminus (achte α-Helix, bestehend aus den Aminosäureresten 280-314) als wichtige strukturelle Determinante identifiziert, die mehrere Substitutionen aufweist, die die Thermostabilität von Cel5A verbessern. Die Variante Cel5A-R17 weist insgesamt drei Substitutionen auf: F16L, Y293F und Q289G. Im Vergleich zum Cel5A-Wildtyp zeigt die Variante R17 eine verbesserte Schmelztemperatur (7,7 °C), Halbwertszeit bei 75 °C (5,5-fach) und T50 (5,1 °C). Gezielte Mutationen im C-Terminus der Endoglucanase Cel5A bestätigen den Einfluss dieses Proteinabschnitts auf die Thermostabilität. Eine hohe Mutationslast am C-Terminus führt nicht zur Inaktivierung des Proteins und es wurde eine neue Variante identifiziert, die die Thermostabilität von Cel5A verbessert, ohne die Aktivität zu beeinträchtigen. Die Variante CE1 (E304V, L307M) weist eine Verbesserung der T50 um 2,1 °C und eine 3,1-fache Verbesserung der Halbwertszeit bei 75 °C auf. Zur Beschleunigung von Enzym-Engineering-Kampagnen und zur Verringerung des Screening-Aufwands wurde die Constraint Network Analysis als computergestütztes Werkzeug eingesetzt, um Positionen zu identifizieren, die die thermische Stabilität von Proteinen verbessern können. Durch den Einsatz der Constraint Network Analysis in der Identifizierungsphase einer KnowVolution-Kampagne konnte der experimentelle Aufwand im Vergleich zur Zufallsmutagenese um 40 % reduziert werden. Die beste Variante, CN5, bestehend aus den Substitutionen T312R, T77G und S308P, zeigte eine verbesserte Tm von 5,0 °C im Vergleich zum Cel5A-Wildtyp. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das molekulare Wissen, das die Thermostabilität der Endoglucanase Cel5A aus der Glykosylhydrolase-Familie 5 bestimmt, generiert wurde. Computergestützte Analysen ergaben, dass die Stabilisierung der C-terminalen Region von Cel5A für eine verbesserte Thermostabilität verantwortlich ist. Dieses Wissen kann mutmaßlich auf andere Hydrolasen derselben Familie übertragen werden. Darüber hinaus kann ein effizienteres Protein-Engineering mit dem Ziel einer verbesserten Thermostabilität durch die Einbeziehung von Computerwerkzeugen in Protein-Engineering-Kampagnen erreicht werden. Die effiziente Entwicklung thermostabiler Cellulasen fördert die Nachhaltigkeit des Biomasseabbaus, indem sie den Verbrauch von Energie und umweltschädlichen Chemikalien sowie die Produktion von Treibhausgasen senkt, was zu Fortschritten auf dem Weg zu einer nachhaltigen Wirtschaft beiträgt.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]