Advances in genotoxicity testing : towards the development of high-throughput and animal-free alternatives in ecotoxicological assessments

  • Weiterentwicklung von Genotoxizitätstests: Entwicklung von Hochdurchsatzmethoden und tierversuchsfreien Alternativen bei ökotoxikologischen Bewertungen

Brendt, Julia; Hollert, Henner (Thesis advisor); Schäffer, Andreas (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021, 2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Die zunehmende Nutzung und die weitere Entwicklung von mehr und mehr Chemikalien, z.B. in der Pharmaindustrie, sowie auch die Gesetzgebung für die Zulassung solcher Stoffe machen eine schnelle Testung neuer Substanzen nötig. Um das Risiko einer Kontaminierung der Umwelt und damit auch die Gefahr für die menschliche Gesundheit möglichst gering zu halten, ist eine umfassende Risikobewertung neuer Stoffe nötig. Die Bewertung der Chemikalien oder Proben erfolgt dabei auf verschiedenen Ebenen, beispielsweise auf Organismusebene, aber auch auf zellulärer Ebene. Dabei werden mehr und mehr Tierversuche durch in vitro Testmethoden ersetzt. Allerdings sind einige der in vitro Testsysteme trotz allem auf tierische Komponenten angewiesen. Eine dieser tierischen Komponenten ist das externe Metabolisierungssystem S9, welches die Säugerleber in den durchgeführten Tests simuliert. Es wird meist aus Rattenlebern hergestellt und in in vitro Tests eingesetzt, z.B. zur Bewertung der Genotoxizität. Im Sinne des 3R-Prinzips (Refinement, Reducement, Replacement) sollten allerdings auch diese tierischen Komponenten mehr und mehr durch tierversuchsfreie Alternativen ersetzt werden. Eine mögliche Alternative findet sich in ewoS9R, das durch Dr. Andreas Schiwy und seinen Kollegen an der RWTH Aachen entwickelt wurde mit Unterstützung von der Exzellenzinitiative (SeedFunds) und dem BmWi Exist-Projekt EWOMIS. Um die Vergleichbarkeit zu bereits publizierten Studien zu wahren, sollte die tierversuchsfreie Alternative allerdings in der Lage sein, das herkömmlich genutzte Ratten-S9 vollständig zu ersetzen. Andernfalls könnten falsche Vergleiche zwischen verschiedenen Studien gezogen werden. Daher wurde das ewoS9R in dieser Arbeit gegen ein herkömmliches Rattenprodukt in den Genotoxizitätstests Ames Fluktuationstest und Mikrokerntest getestet. Der Ames Fluktuationstest zeigt das mutagene Potential einer Substanz oder Umweltprobe auf. Durch das mutagene Potential kann es zur Veränderung der DNA und damit zur Weitergabe dieser Änderung an die nächste Generation kommen. In dieser Arbeit wurden dazu im Ames Fluktuationstest die beiden Standardteststämme Salmonella typhimurium TA 98 und TA 100 genutzt, da die Kombination aus beiden Stämmen die meisten mutagenen Proben erkennt. Der Mikrokerntest kann mit verschiedenen Primärzellen und Zelllinien durchgeführt werden und soll genotoxische Effekte auf die DNA, Chromosomen sowie die Zellteilung aufzeigen. In dieser Arbeit wurden V79-Zellen aus dem chinesischen Hamster (Cricetulus griseus) genutzt. Beide Systeme sind weitverbreitete Tests in der Genotoxizitätsbewertung. Im Rahmen des Vergleichs von ewoS9R zum herkömmlichen Ratten-S9 wurden 12 verschiedene Substanzen, welche bekannte genotoxische Wirkungsweisen besitzen, in beiden Testsystemen getestet. Dabei zeigte sich großes Potential, das Metabolisierungssystem Rattenleber-S9 zu ersetzen, obwohl das ewoS9R in einem deutlich geringeren Proteingehalt eingesetzt werden musste als das herkömmliche S9. Daher ist ein direkter Vergleich beider Metabolisierungssysteme schwierig. Zusätzlich wurden jeweils eine neue Methode des Ames Tests als auch des Mikrokerntests entwickelt, um noch eine schnellere Testung von Substanzen zu ermöglichen: der Ames RAMOS-Test und ein günstiger Hochdurchsatz Mikrokerntest. RAMOS bedeutet Respiration Activity Monitoring System und erlaubt die online Überwachung des Sauerstoffverbrauchs im Wachstum der Bakterien im Ames Test. Der neue Mikrokerntest wurde auf Wellplatten durchgeführt, um eine gleichzeitige Testung von mehr Substanzen zu ermöglichen. Um auch die Zeit der Evaluierung des Mikrokerntests zu beschleunigen, wurden ein automatisches Mikroskop und eine Zählsoftware genutzt. Beide Testsysteme ermöglichen eine Testung von mehr Proben in weniger Zeit, die RAMOS-Technologie liefert zusätzlich noch Informationen über das Wachstum der Bakterien während des Tests, welches im Ames Fluktuations-Test nicht überwacht werden kann. Nichtsdestotrotz ist weitere Forschung nötig, sowohl an den Testsystemen, als auch am tierversuchsfreien Metabolisierungssystem, um eine sicherere und ressourcenschonendere Zukunft zu erhalten.

Einrichtungen

  • Fachgruppe Biologie [160000]
  • Lehrstuhl für Umweltbiologie und -chemodynamik [162710]

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