Lignin aromatics valorization by Pseudomonas putida : novel strategies to increase the production of mcl-polyhydroxyalkanoate and cis,cis-muconic acid

Ramirez-Morales, Juan Esteban; Blank, Lars M. (Thesis advisor); Rabaey, Korneel (Thesis advisor); Agler-Rosenbaum, Miriam (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021, 2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021. - Dissertation, Ghent University, 2021

Kurzfassung

Lignin, ein Hauptbestandteil der Lignocellulose-Biomasse, ist das am häufigsten vorkommende aromatische Polymer auf unserem Planeten. Somit stellt es eine erneuerbare und nicht fossile Quelle für Aromaten dar, die verspricht, den Übergang zu einer zirkulären Bioökonomie positiv zu beeinflussen. Obwohl es sich um eine wertvolle chemische Ressource handelt, wird Lignin immer noch nicht ausreichend genutzt. In den letzten Jahren hat sich ein Paradigmenwechsel bei der Implementierung neuer Bioraffinerien ergeben und es wird vermehrt Wert auf die chemo- und / oder biokatalytische Aufbereitung von Ligninaromaten zu wertvollen Produkten gelegt. Insbesondere bei der biokatalytischen Umwandlung verspricht die natürliche katabolische Fähigkeit vieler Pseudomonaden Aromaten zu nutzen, die inhärente aromatische Heterogenität von depolymerisierten Lignin-Gemischen zu erleichtern. Gleichzeitig können einige Pseudomomas-Stämme wertvolle Moleküle für die Polymerindustrie wie Polyhydroxyalkanoate mittlerer Kettenlänge (mcl-PHA) und cis,cis-Mukonsäure synthetisieren. Während durch Metabolic Engineering enorme Fortschritte bei der Verbesserung der Umwandlung von Aromaten in mcl-PHA erzielt werden, gibt es eine erhebliche Lücke im detaillierten Verständnis von Bioprozessen, insbesondere bei Gemischen von Aromaten aus Lignin. Analog dazu verhindern, trotz wichtiger Fortschritte bei der Stamm- und in der Bioprozessentwicklung, Limitationen durch toxische Effekte der Produktinhibierung immer noch, dass industriell relevante Produktivitäten von cis,cis-Mukonsäure aus Ligninsubstraten erreicht werden. Durch das Verständnis der Schlüsselfaktoren für eine erfolgreiche Biokonversion und deren Umsetzung in innovative Bioprozessstrategien sollte die Produktion von mcl-PHA und cis,cis-Mukonsäure aus Ligninaromaten gesteigert werden. Nach schrittweisen Screenings und vergleichenden Kultivierungen mehrerer bekannter Stämme der Pseudomonas-Familie bestätigte diese Arbeit eindeutig, dass Pseudomonas putida KT24440 der robusteste, vielseitigste und leistungsfähigste Biokatalysator für die Akkumulation von mcl-PHA aus einem definierten aromatischen Lignin-Gemisch ist. In einem nächsten Schritt wurde die detaillierte Aromatenverwertung und die mikrobielle Stoffwechselaktivität durch Online-Messungen des Sauerstoffverbrauchs aufgelöst. Durch diese Untersuchungen wurde die Verfügbarkeit von Sauerstoff und Stickstoff als Schlüsselfaktor für eine erfolgreiche biokatalytische Verbesserung identifiziert. Insgesamt wurde die Bildung von mcl-PHA im Wildtyp-Stamm unter technisch relevanten Bedingungen um bis zu 43% (mg mcl-PHA mg-1 CDW) verbessert. Die höchste mcl-PHA-Konzentration (582 mg L-1) wurde für ein C/N-Verhältnis von 60 unter Bedingungen ohne Sauerstofflimitierung erhalten (Sauerstoffübertragungsrate ≥ 20 mmol L-1 h-1). Im Gegensatz dazu akkumulierten aromatische Zwischenprodukte unter sauerstofflimitierten Bedingungen bei Sauerstoffübertragungsraten unter 10 mmol L-1 h-1. Durch diese Bioprozess-Charakterisierung wurde die Leistungsfähigkeit des biokatalytischen Aromatenumwandlung in P. putida KT2440 vorhersehbar und die experimentellen Bedingungen basierend auf der Sauerstoffübertragungsrate in einen 1-l-Rührkessel-Bioreaktor skalierbar. Schließlich wurden die Vorteile von Strategien zur gleichzeitigen Optimierung von Biokatalysatoren und Bioprozessen demonstriert. Eine 1,9-fache Erhöhung der mcl-PHA-Konzentration und eine 1,5-fache Erhöhung des mcl-PHA-Gehalts wurden aus Ligninaromaten erzielt. Um den negativen, toxischen Effekt der Produktakkumulation von cis,cis-Mukonsäurezu mildern, wurde in dieser Arbeit auch eine innovative Lösung zur Inline-Extraktion von cis,cis-Mukonat etabliert, das von einem genetisch verändertem Stamm von P. putida KT2240 gebildet wird. Die Umsetzung folgte einem systematischen Ansatz der Prozessentwicklung. Zunächst wurde eine elektrolytische Extraktion von cis,cis-Mukonat hinsichtlich Rate und Coulombischer-Effizienz aus einem synthetischen Medium charakterisiert. Parallel dazu wurden die Bioproduktionsraten von cis,cis-Mukonsäure in einem herkömmlichen Bioprozessen definiert und die negative Wirkung von cis, cis-Mukonsäure auf die Kultur bei einer Schwellenkonzentration von 195 mM (27,7 g L-1) bestätigt. Anschließend wurden elektrolytische Langzeitextraktionen in höherem Maßstab unter Verwendung von Fermentationsbrühen als Annäherung an den Endprozess durchgeführt. Diese Erfahrung diente dazu, relevante technische Nachteile im Zusammenhang mit der Ausfällung von Mukonsäure in der anodischen Kammer zu identifizieren und zu lösen. Die Lösung bestand aus einer pH-Kontrolle bei 3,5, was ein geeigneter pH war, bei dem höhere Mengen der Mukonsäureisomere cis,cis- und cis,trans- in Lösung gefunden wurden (d. h. nicht als ausgefällte Form). Dies war entscheidend, um eine stärkere Anreicherung von Mukonat im Anolyten zu ermöglichen. Basierend auf allen Prozessparametern (d. h., den Bioproduktionsraten und der extraktiven Elektrolyseleistung), die aus den getrennten Schritten erhalten wurden, wurde eine endgültige Prozessintegration abgeleitet. Durch die Durchführung der InLine-Extraktion aus einem Bioreaktor wurde die volumetrische Produktivität von cis,cis-Muonat gegenüber einem herkömmlichen parallel laufenden Bioprozess um 15,6% erhöht.Insgesamt trägt diese Studie dazu bei, unser Verständnis der biokatalytischen Fähigkeit des vielversprechenden Bakteriums P. putida KT2440 zur effizienten Umwandlung von Ligninaromaten für zukünftige Bioraffinerieanwendungen zu vertiefen. Darüber hinaus wurde erstmals in einer mikrobiellen Kultivierung das Potenzial der selektiven Entfernung von cis,cis-Muconsäure nachgewiesen, was einen wichtigen Schritt zur Etablierung eines kostengünstigen Bioproduktionssystems darstellt.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Institut für Angewandte Mikrobiologie (Biologie IV) [161700]