A large-scale RNAi-based screen for modifiers of FUS-induced neurotoxicity in Drosophila melanogaster

Pan, Xia; Marquardt, Till (Thesis advisor); Wagner, Hermann (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021, 2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine neurodegenerative Erkrankung, die durch den vorzeitigen Verlust der oberen und unteren motorischen Neuronen gekennzeichnet ist. Der Verlust motorischer Neurone führt zu Muskelschwäche und -atrophie. Diese Neurodegeneration führt typischerweise innerhalb von fünf Jahren nach Einsetzen der ersten Symptome zur Lähmung bis hin zum Tod des Patienten. Die meisten Fälle von ALS sind sporadisch (sALS), nur etwa 10% sind erblich bedingt (familiäre ALS, fALS). Das Fused in Sarcoma (FUS)-Protein ist ein RNA-bindendes Protein, das mehrere Ebenen des RNA-Stoffwechsels beeinflusst, einschließlich der Transkription, des Spleißens und des Transports von messenger-RNA (mRNA). Die Anreicherung von FUS im Zytoplasma ist ein charakteristisches Merkmal von ALS-Patienten. Obwohl bereits vor zehn Jahren postuliert wurde, dass mutiertes FUS eine der Ursachen für ALS war, sind die ursächlichen zellulären Mechanismen der FUS-ALS- Pathogenese noch unklar. Die Fruchtfliege Drosophila melanogaster ist ein etabliertes Tiermodell für die zelluläre Pathologie von ALS, da sie eine kurze Generationszeit besitzt, einfach zu handhaben ist und die gezielte genetische Manipulation von in verschiedenen Geweben exprimierten Proteinen ermöglicht. Drosophila, die entweder Wildtyp- oder ALS-spezifisches mutiertes FUS exprimieren, ermöglichen die Analyse der Auswirkungen von FUS und ermöglichen so tiefergehende Einblicke in die Neuropathologie des FUS-Proteins in vivo. In der vorliegenden Arbeit zeigten Fliegen, die Wildtyp-FUS exprimierten, einen schwereren Phänotyp als Fliegen, die ALS-typisches mutiertes FUS exprimierten, nämlich eine verkürzte Lebensdauer und reduzierte Lokomotion. Daher wurde Wildtyp-FUS für ein RNAi-basiertes genetisches Screening verwendet. Die Expression von Wildtyp-FUS in Drosophila-Komplexaugen resultierte in einem "rauhen" Augenphänotyp (rough eye phenotype, REP). Die Schwere des FUS-abhängigen Augenphänotyps korrelierte mit einer Degeneration der Photorezeptoren, d.h. je stärker der REP, desto stärkere Degeneration wiesen die Photorezeptoren auf. Paralleles Silencing einzelner Gene mittels RNAi in FUS-exprimierenden Komplexaugen wurde zur Identifikation derjenigen genetischen Modifikatoren angewendet, die FUS-induzierte REP unterdrücken beziehungsweise verbessern. Die Kenntnis solcher genetischen Wechselwirkungen kann neue Erkenntnisse über pathologische Mechanismen liefern, die zur neuronalen Degeneration in ALS beitragen. Der in der vorliegenden Arbeit verwendete Ansatz ermöglichte ein simples Screening für Modifikatoren. Wir haben etwa 7.000 einzelne Gene in Drosophila ausgeschaltet und die Fliegen auf Veränderungen im FUS-induzierten REP untersucht, was zur Identifikation von mehr als 300 Modifikatoren FUS-induzierter Toxizität führte. Die von den Kandidatengenen kodierten Proteine sind an verschiedenen Signalwegen und molekularen Funktionen beteiligt. Zusammengenommen führten diese Ergebnisse zur Identifikation neuartiger Modifikatoren FUS- induzierter Neurotoxizität und trugen so zur Aufklärung von Mechanismen FUS-bezogener ALS- Pathogenese bei.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Neurobiologische Forschung [164310]