Bacillus pumilus als Plattform für die Produktion technischer Enzyme

• Bacillus pumilus as a platform for the production of technical enzymes

Küppers, Tobias; Schwaneberg, Ulrich (Thesis advisor); Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor)

Aachen : RWTH Aachen University (2021, 2022)
Doktorarbeit

Dissertation, RWTH Aachen University, 2021

Kurzfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung einer alternativen Produktionsplattform zur Produktion alkalischer Hydrolasen, welche industriellen Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln finden. Der zur Verfügung gestellte Ausgangsstamm B. pumilus Jo2 soll dazu in Referenz zu Bacillus licheniformis E, dem bestehenden industriellen Produktionsstamm der Henkel AG & Co. KGaA, bzw. seit 06-2013 BASF SE, mit zugehörigem herabskalierten Produktionsprozess bis hin zu kompetitiven Ausbeuten entwickelt werden. Unter Verwendung der etablierten Waschmittelprotease BL18 wurde der Ausgangsstamm B. pumilus Jo2 in Referenz zum etablierten Produktionssystem B. licheniformis E als neue alternative Plattform zur technischen Enzymproduktion entwickelt. Dabei ermöglichte das Zusammenspiel von Prozess- und Expressionsoptimierung, bei dem verschiedene homologe Promotorsequenzen identifiziert wurden, für das generierte B. pumilus-System das Erreichen kompetitiver Produkttiter bis hin zu einem Titer von 114,5% bzw. einer Steigerung von 14,5% gegenüber B. licheniformis E. Weiterhin wurde eine Erfindungs-meldung über die Verwendung der identifizierten homologen Promotorsequenzen zur Enzymexpression eingereicht (WO2013113689). In einer abschließenden, explorativen Expressionsstudie zur Produktion nichtproteolytischer Enzyme erzielte die entwickelte B. pumilus-Plattform unter Verwendung der aus Bacillus spec. A7-7 stammenden α-Amylase einen relativen Produkttiter von maximal 65,7% bezogen auf den Proteasetiter von B. licheniformis E. Die dabei erzielte Enzymkonzentration von deutlich über 4 g/L belegt das herausragende Potential des entwickelten Systems, welches insbesondere unter Berücksichtigung der nicht auf die Amylase-produktion zugeschnittenen Parameter wie z. B. Medienzusammensetzung, Prozessführung, Stammhintergrund und Expressionsprofil weiteres Optimierungspotential des Systems aufzeigt. Über die Entwicklung der B. pumilus-Produktionsplattform hinaus wurde zur Aufklärung der Substratverwertung die De-novo-Synthese von Aminosäuren ausgehend von Komplex-substrat und Glukose mittels einer 13C-Markierungsstudie untersucht. Dabei wurde neben dem Substratfluss in Zentralstoffwechsel- und Aminosäurepools ein aus Glukose stammender 13C-Anteil von 47,1 ± 4,2% im Produkt nachgewiesen. Weiterhin wurden Ausgangspunkte zu Bottleneck- und Substratoptimierungen hinsichtlich einer energetisch effizienteren Substratnutzung (Ala, Asp/Asn, Ser, Val) identifiziert. Mittels Proteomanalyse wurde abschließend das Flagellenprotein Hag wie auch extrazelluläre Proteine (BglS, PelB) als potentielle Deletionsziele zur weiteren Optimierung der entwickelten Plattform aufgezeigt.

Einrichtungen

• Fachgruppe Biologie [160000]
• Lehrstuhl für Biotechnologie [162610]